载脂蛋白E4对原代海马神经元钙稳态的作用：一项体外研究

《Frontiers in Neuroscience》：The role of apolipoprotein E4 on calcium homeostasis in primary hippocampal neurons: an in vitro study

　　

摘要
背景：研究人员先前在转基因小鼠模型中证明，载脂蛋白E（apoE4）可加速神经退行性变，但机制尚不明确。既往研究报道，死亡相关蛋白激酶1（death-associated protein kinase 1, DAPK1）与N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartate, NMDA）受体的NR2B亚基相互作用，该DAPK1–NR2B相互作用增加细胞内钙摄入，导致细胞损伤。由于apoE4是散发性阿尔茨海默病（sporadic Alzheimer’s disease, sAD）最强的遗传风险因素，而钙稳态失衡是sAD相关神经毒性的关键驱动因素，apoE4与钙失衡之间的机制尚不明确，这仍是开发sAD靶向治疗的关键空白。填补这一空白对于加深对sAD发病机制的理解和识别新的治疗靶点十分紧迫。本研究旨在确定apoE4的神经毒性作用是否由DAPK-1与NMDA受体NR2B亚基之间的相互作用介导。
方法：在有无优先靶向含NR2B受体的NMDA受体拮抗剂的情况下，用apoE培养原代小鼠海马神经元。检测细胞内钙浓度、细胞活力及钙稳态相关蛋白。
结果：经apoE4处理的细胞表现出细胞内钙水平升高和细胞死亡增加。在apoE4培养条件下，DAPK-1和NR2B的表达上调，并相互结合。
结论：本研究表明，apoE4通过增加细胞内钙浓度引起神经毒性。其可能机制是apoE4增加了DAPK-1/NMDAR2B的表达，并进一步促进二者之间的相互作用。这些结果可能为AD的治疗提供新的靶点和思路。

论文解读：apoE4通过DAPK1-NMDAR2B相互作用破坏海马神经元钙稳态

研究背景与目的：载脂蛋白E4（apolipoprotein E4, apoE4）是散发性阿尔茨海默病（sporadic Alzheimer's disease, sAD）最主要的遗传风险因素，单个等位基因使sAD风险增加约3倍，双等位基因携带者风险较APOE3携带者增加15倍，而APOE2每个等位基因与AD风险降低约2倍相关。研究人员此前发现，E4FAD小鼠通过下调N-甲基-D-天冬氨酸受体（N-methyl-D-aspartate receptor, NMDAR）信号通路，表现出与年龄相关的认知功能和突触蛋白显著下降。NMDAR是中枢神经系统中广泛表达的谷氨酸门控离子通道，对钙离子（Ca²⁺）高度通透，其过度激活——尤其是含NR2B亚基的亚型——可引发病理性Ca²⁺内流、激活促死亡信号通路并最终导致神经元损伤。死亡相关蛋白激酶1（death-associated protein kinase 1, DAPK1）是一种钙调蛋白依赖性丝氨酸/苏氨酸激酶，既往研究显示其可与NMDA受体NR2B亚基特异性结合并诱导卒中发生。尽管已有研究分别报道apoE4与钙稳态失衡相关、DAPK1与NMDAR2B相互作用可调节钙内流，但尚无研究直接阐明DAPK1-NMDAR2B复合物是否介导apoE4诱导的钙稳态失衡。这一空白限制了针对apoE4相关AD的靶向治疗开发。因此，研究人员提出假说：apoE4的神经毒性部分由DAPK1-NMDAR2B相互作用介导，该作用驱动异常钙内流及随后的神经元死亡。本研究旨在原代小鼠海马神经元中验证这一具体机制。

主要技术方法：研究人员从南京大学模型动物研究中心购买的6只孕E20 5xFAD小鼠中获取胚胎（共22只），分离海马并进行原代培养。主要方法包括：MTT法检测细胞活力；荧光显微镜Fluo-3/AM成像、荧光酶标仪及流式细胞术检测细胞内钙浓度；免疫印迹检测NMDAR1、NMDAR2A、NMDAR2B、DAPK-1、p-CaMK-II、p-CREB及BDNF蛋白表达；免疫共沉淀验证DAPK1与NMDAR2B的相互作用；免疫荧光染色观察蛋白共定位。所有实验均设置apoE2、apoE3、apoE4及对照（vehicle）四组，每组n=6个独立生物学重复。

研究结果：
（1）ApoE4以钙依赖方式降低海马神经元活力。MTT结果显示，0.2 μM apoE4处理48小时后，细胞密度降低并最终脱落；apoE4浓度>0.05 μM时表现出神经毒性，而apoE3和apoE2在各浓度下均无明显毒性作用，表明apoE4毒性呈剂量和亚型依赖性。进一步使用Indo-1 405/490 nm比率和流式细胞术检测发现，apoE4组细胞内Ca²⁺水平显著高于其他组。使用优先靶向含NR2B受体的NMDA受体拮抗剂ifenprodil可降低细胞内钙浓度，并显著减轻apoE4的神经毒性，证实apoE4降低细胞活力依赖于钙离子。
（2）ApoE4增加原代海马神经元中NMDAR亚基的表达。由于NMDAR表达上调可增加Ca²⁺内流，研究人员通过免疫印迹检测NMDAR1、NMDAR2A和NMDAR2B的表达水平，结果显示apoE4组三种亚基的表达均高于apoE2、apoE3和对照组。
（3）ApoE4降低p-CaMK-II、p-CREB和BDNF的表达。免疫印迹检测发现，apoE4处理组的磷酸化钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II（p-CaMK-II）、磷酸化cAMP反应元件结合蛋白（p-CREB）和脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor, BDNF）蛋白水平均低于其他组，这些分子与钙摄取通路相关，其下调可进一步促进钙内流。
（4）DAPK-1与NMDAR2B的相互作用调节apoE4的神经毒性。免疫印迹显示apoE4处理组DAPK-1表达显著增加。免疫共沉淀结果表明，在apoE4处理条件下，NMDAR2B可与DAPK-1结合。免疫荧光实验进一步观察到NMDAR2B与DAPK1在神经元中共定位。这些结果提示apoE4可能通过上调DAPK-1和NMDAR2B表达并促进二者结合，导致细胞内钙超载。

讨论与结论：讨论部分指出，apoE4而非apoE2或apoE3在体外和体内均可产生神经毒性，与既往研究一致；apoE4处理的细胞出现DAPK-1表达增加及DAPK1-NMDAR2B结合，与既往卒中研究中的机制相似。此外，apoE4还下调BDNF表达，这与BDNF缺乏加剧NMDAR介导钙毒性的观点相符。研究人员强调，与既往仅将DAPK1-NMDAR2B关联至卒中或将apoE4关联至钙失衡的研究不同，本研究首次证明DAPK1-NMDAR2B特异性介导apoE4诱导的钙超载。讨论还承认了研究局限性，包括胚胎海马神经元无法完全模拟晚发型AD病理、使用单一浓度apoE4、仅使用ifenprodil作为药理学工具、未考虑胶质-神经元互作及血脑屏障功能等。结论部分总结：apoE4通过上调DAPK1和NMDAR2B表达、促进其物理相互作用，放大病理性钙内流从而诱导原代海马神经元神经毒性。靶向DAPK1-NMDAR2B相互作用（如小分子抑制剂或肽阻断剂）可能为apoE4携带者提供精准治疗策略。未来研究需在APOE4/5xFAD双转基因小鼠中验证该轴、筛选阻断DAPK1-NMDAR2B结合的候选化合物，并探索其他钙调节通路与这一轴的交互作用。该研究发表于《Frontiers in Neuroscience》，为apoE4相关AD的机制理解和靶向治疗提供了新方向。