通过HubZIP6介导的CBF激活和水杨酸信号增强火龙果耐寒性

《Molecular Horticulture》：Enhancing cold tolerance through HubZIP6-mediated CBF activation and salicylic acid signaling in pitaya

　　

冷胁迫严重限制了水果作物的产量和品质，然而其在火龙果中的调控机制仍不清楚。研究人员在此鉴定到一个冷诱导的bZIP转录因子（basic leucine zipper transcription factor, bZIP）HubZIP6，它在增强火龙果耐寒性中发挥核心作用。HubZIP6是一个定位于细胞核的蛋白质，具有转录激活活性，其在拟南芥（Arabidopsis）和番茄中的过表达显著提高了耐寒性，表现为更高的存活率、降低的离子渗漏和较低的活性氧（reactive oxygen species, ROS）积累。在机制上，HubZIP6直接结合HuCBF1和HuCBF3启动子中的ACGT基序，从而在冷胁迫下激活它们的表达。此外，HubZIP6与水杨酸结合蛋白HuSABP2发生物理相互作用，协同增强HuCBF基因的转录激活。值得注意的是，HubZIP6还直接激活HuSABP2，形成一个连接CBF转录调控与水杨酸信号的调控环路。一致地，HuSABP2的过表达进一步增强了转基因植物的耐寒性。总之，这些发现表明，耐寒性通过HubZIP6介导的CBF激活和水杨酸信号的整合得以增强，为改善水果作物逆境抗性提供了一个有前景的遗传靶点。

冷胁迫（cold stress）包括 chilling stress（0–15°C）和 freezing stress（<0°C），是严重影响植物生长、发育和农业生产的重要非生物胁迫因素。火龙果（pitaya）作为热带水果，对低温极为敏感，冷胁迫不仅造成产量降低、品质下降和经济损失，严重时还导致植株死亡。目前，火龙果冷胁迫响应的分子调控机制仍不清楚。在植物冷信号通路中，DREB1/CBF（dehydration responsive element binding factor 1/C-repeat binding factor）转录因子是核心调控因子，可直接激活下游冷响应（cold regulated, COR）基因；bZIP转录因子家族在多种非生物胁迫应答中发挥广泛作用，但bZIP对CBF的调控在火龙果中尚未见报道。此外，水杨酸（salicylic acid, SA）信号在冷胁迫中的作用，特别是SA结合蛋白（SA-binding protein, SABP）在火龙果中的功能也缺乏研究。基于此，研究人员利用转录组测序和分子生物学手段，系统解析了火龙果耐寒的新调控模块。该研究鉴定到一个冷诱导的bZIP转录因子HubZIP6，揭示了其通过直接激活HuCBF1/HuCBF3以及调控HuSABP2介导的SA信号来增强耐寒性的新机制，相关成果发表在《Molecular Horticulture》。

研究人员首先以两个火龙果品种‘SCAU-NH’（耐低温）和‘SCAU-KX’（低温敏感）为材料，利用转录组测序（PRJNA1335801）筛选并克隆了HubZIP6及HuSABP2。随后采用了以下关键技术方法：（1）亚细胞定位与转录激活分析（双荧光素酶报告系统、酵母系统）；（2）GUS启动子活性分析；（3）酵母异源表达验证冷耐受；（4）拟南芥和番茄遗传转化及冷胁迫表型鉴定；（5）生理指标测定包括离子渗漏、丙二醛（MDA）、H₂O₂、O₂^?、脯氨酸、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）和SA含量；（6）采用双荧光素酶报告（DLR）、酵母单杂交（Y1H）和凝胶迁移率变动分析（EMSA）验证转录因子与启动子的直接结合；（7）采用酵母双杂交（Y2H）、荧光素酶互补成像（LCI）和GST pull-down验证蛋白互作。

研究结果如下：

**1. 冷响应bZIP转录因子HubZIP6的基因克隆与特征分析**
通过转录组测序和qRT-PCR确认HubZIP6在耐冷品种中受冷诱导持续上调；亚细胞定位显示其定位于细胞核；双荧光素酶报告和酵母实验证明HubZIP6具有转录激活活性，且其C端65–135位氨基酸为转录激活区域；GUS染色显示HubZIP6启动子受低温诱导；在酵母系统中异源表达HubZIP6可提高酵母在低温下的生长能力。

**2. 过表达HubZIP6提高转基因拟南芥的耐寒性**
在拟南芥中过表达HubZIP6后，与野生型相比，转基因株系在非冷驯化和冷驯化条件下的存活率显著提高，离子渗漏、MDA含量和ROS水平降低，而拟南芥突变体则表现相反；同时AtCBF1、AtCBF2、AtCBF3和AtCOR47的表达在过表达株系中显著上调，在突变体中下调。

**3. HubZIP6增强转基因番茄的耐寒性**
在番茄中过表达HubZIP6，经4°C处理后转基因植株叶片损伤较轻，DAB和NBT染色显示ROS积累明显减少，MDA和离子渗漏降低，SOD、POD、CAT活性和脯氨酸含量增加，SlCBF1/2/3和SlCOR47表达水平显著高于野生型。

**4. HubZIP6通过直接结合HuCBF1和HuCBF3的启动子激活其转录**
经DLR、Y1H和EMSA实验证明，HubZIP6可直接结合HuCBF1和HuCBF3启动子中的ACGT核心基序并激活其表达，但HuCBF2启动子不受HubZIP6调控，表明该调控具有特异性。

**5. HubZIP6-HuSABP2相互作用增强了HubZIP6对HuCBF1和HuCBF3启动子的结合能力**
通过Y2H、LCI和GST pull-down实验证实HubZIP6与HuSABP2发生物理互作；DLR实验显示二者共表达时对HuCBF1和HuCBF3启动子的转录激活作用比单独表达HubZIP6更强，说明HuSABP2可协同增强HubZIP6的转录激活功能。

**6. HubZIP6通过直接结合其启动子激活HuSABP2的转录**
Y1H、EMSA和DLR实验表明，HubZIP6可直接结合HuSABP2启动子中的三个ACGT基序并激活其转录，从而形成HubZIP6→HuSABP2的正向调节关系。

**7. HuSABP2响应低温胁迫**
在冷处理过程中，HuSABP2在两种火龙果品种中的表达均持续上升；亚细胞定位显示HuSABP2定位于细胞质；GUS分析表明HuSABP2启动子受低温诱导；酵母系统表达HuSABP2可提高酵母在低温下的存活能力。

**8. 过表达HuSABP2增强转基因拟南芥的耐寒性**
在拟南芥中过表达HuSABP2显著提高植株耐寒性，SA含量、SOD/POD/CAT活性和脯氨酸含量升高，离子渗漏、MDA和ROS水平降低，同时AtSOD、AtPOD、AtCAT和SA合成基因AtICS1的表达上调；sabp2突变体则表现出耐寒性降低。

**9. HuSABP2增强转基因番茄的耐寒性**
过表达HuSABP2的番茄植株在冷处理后叶片受害明显轻于野生型，ROS、MDA和离子渗漏降低，SA含量和抗氧化酶活性升高，SlCOR47、SlCOR413-like、SlSOD和SlPOD表达上调，进一步证实了HuSABP2的积极作用。

在讨论部分，研究人员总结了bZIP转录因子在冷胁迫中的双向调控作用，例如小麦TabZIP6作为负调控因子，而苹果MdHY5作为正调控因子。本研究表明HubZIP6是火龙果中通过CBF依赖途径正调控耐寒性的bZIP因子。关于SA信号，SABP2作为酯酶可将无活性的水杨酸甲酯（MeSA）转化为活性SA，从而增强抗逆性；本研究首次在火龙果中证明HuSABP2受HubZIP6直接激活，并与HubZIP6互作协同增强CBF表达，构成“HubZIP6–HuCBF1/3–HuSABP2–SA”的调控网络。研究结论认为，HubZIP6和HuSABP2是火龙果耐寒性的重要基因资源，为火龙果及其近缘植物的耐寒遗传改良提供了理论依据和候选靶点。