《Experimental Hematology & Oncology》：Single-cell mapping of thymus-dependent na?ve t-cell regeneration reveals CD61-associated states after hematopoietic stem cell transplantation
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胸腺依赖性的从头T细胞生成对于维持T细胞多样性和免疫能力至关重要。尽管青春期后胸腺退化减少了胸腺输出，残余胸腺功能对于造血干细胞移植（HSCT）后的免疫监视和免疫重建仍然重要。然而，区分胸腺来源初始T细胞与通过外周稳态扩张维持的初始T细胞的细胞特征仍知之甚少。
胸腺依赖性的从头T细胞生成对于维持T细胞多样性和免疫能力至关重要。尽管青春期后胸腺退化减少了胸腺输出，残余胸腺功能对于造血干细胞移植（HSCT）后的免疫监视和免疫重建仍然重要。然而，区分胸腺来源初始T细胞与通过外周稳态扩张维持的初始T细胞的细胞特征仍知之甚少。在此，研究人员采用同系GFP标记小鼠移植模型，结合纵向单细胞转录组和T细胞受体库分析，以确定HSCT后初始T细胞再生的起源和动态。通过区分胸腺来源的从头生成T细胞与外周扩张T细胞，研究人员发现近期胸腺输出细胞（RTE）以及CD4?和CD8?初始T细胞优先通过胸腺依赖途径重建。研究人员进一步鉴定了胸腺来源区室中富集的独特初始T细胞状态，包括CD61相关和Ly6C相关初始T细胞状态。这些群体在免疫重建过程中表现出动态变化，并与移植和生理性胸腺退化小鼠模型中的胸腺功能状态相关。在人类数据集和原始外周血样本中，CD61相关特征与年龄相关胸腺活性、sjTREC水平和异基因HSCT后胸腺恢复的初步指标相关。总之，该研究定义了HSCT后胸腺依赖性初始T细胞再生的细胞特征，并确定CD61相关初始T细胞状态为与胸腺恢复相关的候选外周特征。这些发现为胸腺依赖性免疫重建提供了新见解，并建立了评估HSCT后胸腺再生外周特征的框架。
# 胸腺依赖性初始T细胞再生：HSCT后免疫重建的细胞特征与CD61相关状态的鉴定
## 研究背景与科学问题
胸腺作为T细胞发育和T细胞受体（TCR）库形成的核心器官，从胎儿期至青春期通过TCR重排及正负选择产生具有广泛抗原识别能力和自身耐受性的多样化T细胞库，从而支持机体对感染和恶性肿瘤的免疫监视。然而，青春期后胸腺发生生理性退化，胸腺输出减少，新生成初始T细胞数量下降。传统观点认为，成年期初始T细胞库主要依赖外周稳态扩张而非持续的胸腺输出维持。但临床证据表明，成人胸腺并非可有可无：心胸外科手术队列中，胸腺切除与新生CD4?和CD8? T细胞产生减少、炎性细胞因子水平升高、癌症发病率增加及全因死亡率升高相关，且超额死亡主要归因于癌症相关死亡而非心血管死亡。这些发现提示成人胸腺可能通过新的T细胞输出、TCR库多样性和免疫监视持续支持长期免疫稳态。
造血干细胞移植（HSCT）不仅是血液系统恶性肿瘤的标准治疗手段，也是重建免疫稳态的有效治疗策略。研究人员前期研究发现，单倍体相合移植患者表现出增强的胸腺输出，表明即使在成年期胸腺功能也能恢复，且对重新建立免疫稳态至关重要。然而，胸腺极易受到免疫损伤，移植相关并发症如移植物抗宿主病（GVHD）可进一步损害胸腺功能。尽管已有若干近期胸腺输出细胞（RTE）标志物被描述，但可靠追踪胸腺依赖性初始T细胞再生的方法仍然有限，尤其在HSCT等再生情境中。区分胸腺来源初始T细胞与外周稳态扩张维持的初始T细胞的细胞和分子特征仍不完全清楚。因此，系统描绘HSCT后胸腺依赖性初始T细胞再生的细胞状态与动态轨迹，鉴定可反映胸腺功能恢复的外周特征，具有重要的基础与临床意义。
## 研究技术与方法
研究人员建立了一种同系GFP标记小鼠移植模型，该模型将经致死性照射的CD45.1受体小鼠输注来自Rosa26-CAG-EGFP供体的GFP?脾脏T细胞（代表外周扩增来源细胞）和来自CD45.2供体的GFP?去T细胞骨髓（TCD-BM）（代表经胸腺发育的从头生成细胞），从而实现对外周扩增与胸腺依赖性再生的直接区分。研究整合了纵向单细胞转录组测序（scRNA-seq，采用10x Genomics平台）、T细胞受体（TCR）库分析及流式细胞术验证。此外，还分析了公共scRNA-seq数据集（小鼠脾脏年轻与年老比较、人类脐带血与外周血GSE157007）和公共微阵列数据集（GSE63117）。临床样本方面，收集了北京大学人民医院健康志愿者（年轻组23例，9-20岁；老年组18例，55-73岁）及异基因HSCT受者（移植后6个月23例和12个月31例）的外周血样本，通过流式细胞术和实时定量PCR（qRT-PCR）检测信号连接T细胞受体切除环（sjTREC）。
## 研究结果
### GFP谱系追踪揭示HSCT后CD4?和CD8?初始T细胞优先通过胸腺依赖途径重建
通过GFP标记移植模型结合scRNA-seq分析，研究在移植后4、8、24周鉴定了包括CD4初始T、CD4效应记忆T（Tem）、CD4调节性T（Treg）、CD4效应T（Teff）、CD4耗竭T（Tex）、CD4 Th17、CD8初始T、CD8中央记忆T（Tcm）、CD8 Tex和CD8 Teff等主要的移植后T细胞群体。时间动态分析显示，外周扩增途径（GFP?）中CD4?和CD8? T细胞在淋巴减少诱导下发生稳态增殖并获得效应和记忆样表型；而胸腺依赖性中枢重建（GFP?）主要产生初始T细胞。流式细胞术验证结果与单细胞转录组结果一致。进一步对初始T细胞进行门控分析发现，大多数初始T细胞来源于胸腺依赖性中枢途径，表明外周扩增T细胞在HSCT后经历显著分化，而移植后大部分初始T细胞由胸腺依赖性途径产生。
### 单细胞分析揭示异质性初始T细胞重建并鉴定Itgb3和Ly6c相关初始T细胞状态
对CD4?初始T细胞进行亚聚类分析，鉴定出Ccr7-初始T、Itgb3-初始T、Ly6c-初始T和Sox4-初始T四种亚群。这些亚群均表达经典初始T细胞标志物（Ccr7、Lef1、Sell、Tcf7）和经典RTE标志物（S1pr1、Pecam1），但呈现不同的转录谱。纵向分析显示，移植后24周初始T细胞区室最接近正常稳态，主要由Ly6c相关初始T细胞组成，而早期时间点主要由Itgb3和Ccr7相关初始T细胞组成。干性评分分析表明Itgb3-初始T细胞在所有初始T细胞亚群中具有最高的干性相关评分，且Pecam1（CD31）表达也最高。拟时间分析显示Itgb3-初始T细胞位于向Tem分化轨迹的位置。Itgb3?初始T细胞约占CD4?初始T细胞区室的25.1%，表现出显著更高的干性评分和RTE特征评分。CD8?初始T细胞也显示出异质性，分为Ccr7-初始T和Ly6c-初始T亚群。公共数据集分析显示Itgb3和Ly6c1在年轻小鼠脾脏中的平均表达水平高于年老小鼠。
### CD61和Ly6C相关初始T细胞与移植和生理性胸腺退化小鼠模型的胸腺功能状态相关
在同系和单倍体相合移植模型中，同系受体中CD4?和CD8?初始T细胞更丰富，表明同系条件下初始T细胞重建更有效。单倍体相合受者中Ly6C-CD4?和CD61-CD8?初始T细胞减少，CD61平均荧光强度（MFI）呈现相同模式。在生理性胸腺退化模型中（年轻9周龄与中年48周龄小鼠比较），中年小鼠胸腺中CD61?CD4单阳性（CD4sp）和CD61?CD8单阳性（CD8sp）胸腺细胞绝对数显著降低。在外周脾脏中，中年小鼠CD4?和CD8?初始T细胞频率和绝对数均降低，CD61相关变化在CD4?区室更为明显，表现为CD61相关初始T细胞频率、绝对数和CD61 MFI显著降低。
### 人类转录组数据集揭示初始T细胞丰度和CD61相关特征与年龄相关胸腺活性的关联
对人类公共scRNA-seq数据（GSE157007，包括脐带血、年轻成人和老年成人）的分析显示，初始T细胞丰度呈现进行性下降趋势，脐带血中最高、年轻个体中等、老年个体最低。RTE相关转录特征评分在初始T细胞中也呈现相似的年龄相关模式。由于ITGB3/CD61在scRNA-seq数据中检出稀疏，研究人员分析了公共微阵列数据集（GSE63117），发现包含初始T细胞、RTE相关和ITGB3相关特征的复合ssGSEA评分在年轻个体中显著高于老年个体。ITGB3表达与初始T细胞特征评分呈正相关，这种关联在年轻个体中更为明显。
### 初始T细胞和CD61?初始T细胞亚群与原代人外周血年龄相关胸腺活性相关
原代人外周血样本分析显示，年轻个体CD4?和CD8?初始T细胞频率更高，CD31?CD4?初始T细胞（CD4 RTE）、CD38?CD4?初始T细胞（CD4 RTE）和CD38?CD8?初始T细胞（CD8 RTE）也富集于年轻组。CD4?初始T细胞中CD61?细胞频率在年轻个体中更高，CD8?初始T细胞中CD61 MFI在年轻组中也增加。sjTREC水平在年轻组中更高。相关性分析显示，CD4?初始T细胞中CD61表达与sjTREC丰度呈正相关（R2=0.50），CD61?初始T细胞频率与经典初始T细胞和RTE指标强相关，与sjTREC水平中等相关。在多变量回归分析中，CD4?区室中CD61在调整sjTREC水平后仍与年龄独立相关。通过对健康供者CD61?和CD61?初始T细胞进行分选并定量sjTREC，发现CD4?和CD8?区室中CD61?初始T细胞均一致地表现出比配对的CD61?对应细胞更高的sjTREC含量。在allo-HSCT受者纵向分析中，CD61?初始T细胞与经典胸腺输出相关亚群（CD31?CD4?初始T细胞和CD38?CD8?初始T细胞）在移植后12个月呈现协调扩增。
## 讨论与结论
本研究表明，外周扩增和胸腺依赖性再生产生的初始T细胞并非具有不同来源的等价群体，而是在免疫重建过程中占据不同的转录状态。胸腺依赖性再生伴随着初始T细胞区室的动态重塑，而非产生单一同质RTE群体。Ly6C和CD61在胸腺相关初始T细胞状态中表现出不同的生物学特征：Ly6C高初始T细胞更接近长期稳态初始T细胞，可能标记小鼠初始T细胞连续体中的成熟相关状态，但因缺乏明确的人类同源基因，转化应用受限。相比之下，ITGB3/CD61在小鼠和人类之间保守，CD61?初始T细胞表现出升高的干性相关转录程序和与既定RTE特征的密切联系，提示CD61识别一种与胸腺依赖性再生相关的初始T细胞状态。研究人员强调，CD61不应被视为既定胸腺输出指标的替代物，而应视为提供互补信息的独特初始T细胞状态标志物。
研究局限性包括：CD61?初始T细胞仅占外周初始T细胞区室的一小部分，直接sjTREC定量仅在有限数量供者中可行；未进行功能研究以确定CD61是否在胸腺细胞成熟、胸腺输出、外周存活或T细胞功能中发挥因果作用；当前队列规模不足以建立CD61相关胸腺恢复与长期临床结局之间的明确关系。
**研究结论**：本研究系统描述了HSCT后初始T细胞再生的细胞和分子特征，揭示了与胸腺依赖性和外周途径免疫重建相关的不同转录状态。研究人员鉴定了在胸腺来源区室中富集的CD61和Ly6C相关初始T细胞状态，并证明ITGB3/CD61在小鼠和人类数据集中均与胸腺相关特征相关联。这些发现凸显了再生初始T细胞中先前未被识别的异质性，为研究胸腺依赖性免疫再生和HSCT后免疫恢复的外周特征提供了框架。该研究发表在《Experimental Hematology》。
