《Journal of Translational Medicine》：Single-cell and single-nucleus transcriptomics of the dorsal root ganglion in neuropathic pain: cell-state remodeling and translational prospects
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神经病理性疼痛仍是一个未被满足的重大临床挑战，现有疗法的疗效有限且耐受性不佳。开发有效镇痛药的主要障碍在于背根神经节（DRG）具有显著的细胞和分子异质性，该结构整合了神经元、胶质细胞、免疫细胞和基质细胞对损伤的反应。单细胞RNA测序（scRNA-seq）和单核
神经病理性疼痛仍是一个未被满足的重大临床挑战，现有疗法的疗效有限且耐受性不佳。开发有效镇痛药的主要障碍在于背根神经节（DRG）具有显著的细胞和分子异质性，该结构整合了神经元、胶质细胞、免疫细胞和基质细胞对损伤的反应。单细胞RNA测序（scRNA-seq）和单核RNA测序（snRNA-seq）的最新进展使得这些反应能够进行细胞类型分辨分析，并揭示了被组织bulk测序所掩盖的疾病相关细胞状态，从而为重新定义疾病机制和治疗优先事项提供了新机遇。本综述综合了周围神经损伤、糖尿病痛性神经病变和化疗诱导神经病变的单细胞研究证据。尽管这些疾病共享广泛的生物学过程，包括神经元状态重塑、胶质稳态支持受损、情境依赖性免疫反应和细胞外基质重组，但它们并未汇聚于单一保守的分子程序。周围神经损伤以神经元损伤与修复状态、反应性和代谢性胶质重塑，以及神经免疫募集和串扰为特征。糖尿病神经病变与感觉编码改变、卫星胶质细胞脂质支持受损和神经退行性重塑相关。化疗诱导神经病变表现出显著的药物特异性异质性，包括紫杉醇处理后亚型选择性神经元脆弱性和金属蛋白酶失调的卫星胶质细胞状态，以及硼替佐米处理后与性别相关的纤维化重塑。这些细胞状态可能发挥适应性、适应不良或退行性功能。然而，由于大多数现有研究依赖单时间点或重复横断面采样，无法直接确定时间进程或因果关系。研究人员进一步探讨了人类DRG图谱如何通过确定候选分子靶点和细胞状态是否保守以及识别其细胞定位，来桥接实验模型与人类疾病。这些数据集还突显了神经元组织和非神经元转录程序的物种特异性差异，这些差异可能限制啮齿动物模型研究结果的直接转化。因此，DRG单细胞研究的主要转化价值在于阐明疾病机制并优先筛选候选治疗靶点以进行进一步研究。将这些发现推向临床应用需要来自人类遗传学、人类DRG转录组数据集、功能验证研究和临床药理学等的补充证据。总体而言，这些互补方法可能促进基于机制和细胞类型指导的镇痛策略的开发。
Introduction
神经病理性疼痛是由躯体感觉神经系统病变或疾病引起的慢性疼痛，表现为自发性疼痛、痛觉过敏和机械性异常性疼痛。其病因包括糖尿病周围神经病变、化疗诱导周围神经病变和三叉神经痛等，常合并焦虑与抑郁，构成显著全球健康负担。现有药物治疗有限，一线药物如加巴喷丁类、三环类抗抑郁药和5-羟色胺–去甲肾上腺素再摄取抑制剂仅能部分缓解症状，阿片类药物则受安全性和长期疗效不确定性的限制。这一治疗困境主要源于临床前模型与人类病理之间的转化鸿沟，以及对疼痛慢性化相关分子异质性认识不足。背根神经节（DRG）包含假单极初级感觉神经元胞体，是躯体感觉传导的关键中继站。由于其血–神经屏障相对通透，DRG易受系统性代谢损伤和神经毒性药物影响。病理条件下，DRG内离子通道表达、神经元兴奋性和异位放电的改变可增加脊髓背角输入并促进中枢敏化。这种重塑还涉及卫星胶质细胞、施万细胞、免疫细胞、血管细胞和基质细胞。传统组织bulk RNA测序会掩盖细胞类型特异性变化和稀缺群体信号。单细胞RNA测序（scRNA-seq）和单核RNA测序（snRNA-seq）的出现使DRG异质性的细胞类型分辨分析成为可能。相比scRNA-seq，snRNA-seq可改善大感觉神经元核的回收率，并适用于冷冻人组织，但仅捕获核转录本。与空间转录组学和计算方法结合时，这些技术能识别疾病相关细胞状态、提示潜在时间轨迹并提名候选细胞间通讯途径。本综述围绕神经病理性疼痛涉及DRG神经元、胶质、免疫和基质区室的协调细胞状态重塑这一概念组织证据，定义细胞状态为特定细胞群体中可重复的转录组构型，并依次介绍技术演变、DRG细胞分类、不同病因的重塑、人类DRG图谱及转化解读。
Methodological considerations for single-cell profiling of the DRG
DRG单细胞分析面临多项技术挑战，影响细胞回收、转录本检测和生物学解释。感觉神经元大小差异显著，且与卫星胶质细胞等非神经元群体紧密相邻。标准流程中，scRNA-seq需对新鲜分离的DRG组织进行酶解和机械解离，可能优先排除大型或脆弱的有髓神经元，并诱导Fos、Jun等应激反应基因。snRNA-seq避免广泛组织解离，提高大神经元群体的回收率，适用于冷冻人组织，但仅捕获核转录本，可能低估细胞质和局部翻译的mRNA。单细胞体深度测序策略结合激光捕获显微切割与Smart-seq2，可生成全长转录组谱，平均每个人类DRG神经元检测超过9000个独特基因，灵敏度显著高于标准snRNA-seq。scRNA-seq和snRNA-seq基本丢失DRG空间组织结构。空间转录组学保留解剖背景，可定位神经元–胶质单元、免疫微环境及疾病相关细胞状态。研究间比较还受批次效应影响，包括测序深度、转录本捕获效率、细胞或核回收率、质控阈值、归一化方法和数据整合策略等。这些因素可能影响聚类分辨率、估计的细胞类型比例和差异表达结果。增强实验设计、数据处理和细胞类型注释的标准化有助于提高可重复性和跨研究可比性。
Cellular taxonomy of the DRG
DRG由异质性的神经元和非神经元细胞群体组成，维持躯体感觉稳态。scRNA-seq和snRNA-seq研究显著细化了其细胞分类学，揭示出比组织学或电生理方法更丰富的多样性。
Sensory neurons
躯体感觉神经元将机械、热和化学刺激转化为电信号，传递至脊髓背角。转录组分析将DRG神经元分为约14–18个保守亚型，大致可归为肽能伤害感受器（PEP，Calca、Tac1阳性）、非肽能伤害感受器（NP，Mrgprd、P2rx3阳性）和NF/Aβ有髓低阈值机械感受器神经元（Nefh、Ntrk2/3阳性）。亚型间存在进一步功能特化，例如共表达Th和Vglut3的C型低阈值机械感受器（C-LTMR）与情感触觉和温度感觉相关。在亚细胞层面，有研究描述了伤害感受器表面的神经元膜蛋白酶体复合物，通过细胞外肽降解调节兴奋性。物种间神经元亚型保守性不完全：小鼠PEP和NP形成转录上离散的簇，而人类伤害感受器呈现更连续的表达谱。人类富集的hPEP.PIEZOh亚型高表达PIEZO2，缺乏明确小鼠对应物，可能参与内脏机械感觉。
Satellite glial cells
卫星胶质细胞（SGCs）包绕单个感觉神经元胞体，形成限制性微环境，支持代谢偶联、钾缓冲和神经递质循环。SGCs存在显著分子异质性，不同亚型偏向与特定神经元类别相关，例如Fabp7富集的SGCs主要位于大机械感受器周围，表达Kir4.1的SGCs优先包裹伤害感受器。SGCs还积极参与脂质代谢，部分亚群富含参与半乳糖神经酰胺生物合成的酶（如Ugt8），通过脂质稳态维持神经元–胶质界面结构完整性。稳态条件下，SGCs高表达Timp3以维持细胞外基质稳定。
Schwann cells
DRG和周围神经中的施万细胞（SCs）分为有髓（Mpz+）和无髓（Ncam1+）亚型。神经损伤后，SCs可逆转为祖细胞样修复表型，上调Jun和神经营养因子如Ngf、Bdnf。单细胞研究进一步扩展了这一分类，鉴定出以高表达神经肽Y（Npy）为特征的压力反应相关施万细胞，通过骨桥蛋白（Spp1）信号协调组织重塑。特定SC亚群还可通过与巨噬细胞相互作用调节局部炎症环境，表明其在免疫调节中比先前认知更为活跃。
Immune cells
DRG驻留免疫微环境主要由巨噬细胞组成，即感觉神经元相关巨噬细胞。单细胞分析显示这些巨噬细胞以激活状态连续谱形式存在，而非经典M1/M2二分法。其功能取决于损伤类型、疾病阶段和局部微环境。其他免疫细胞也可能参与DRG重塑，例如通过Mrgprb2激活的肥大细胞可促进神经源性炎症和疼痛。
Vascular and stromal cells
DRG血管区室由有孔内皮细胞（Pecam1+）和周细胞（Rgs5+、Pdgfrb+）组成，形成比血脑屏障更具通透性的神经血管单元。在代谢应激如高血糖状态下，壁细胞支持减少和内皮紧密连接破坏可能损害屏障功能并促进免疫细胞浸润。DRG和周围神经中的成纤维细胞合成细胞外基质成分，转录组研究区分了神经外膜、神经内膜及相关基质细胞亚群，其中部分可在慢性疼痛或损伤条件下采用以Acta2表达为特征的原纤维化肌成纤维细胞样状态。
Etiology-specific DRG cell-state reprogramming
不同神经病理性疼痛病因以不同方式重塑DRG细胞状态。周围神经损伤、糖尿病神经病变和化疗诱导神经病变共享部分损伤反应程序，但也具有独特的神经元、胶质、免疫和基质特征。
Peripheral nerve injury
周围神经损伤（PNI）常由创伤、压迫或手术并发症引起，临床前模型包括慢性压迫性损伤、 spared nerve injury和脊神经结扎。scRNA-seq和snRNA-seq研究表明，PNI诱导DRG内神经元、卫星胶质细胞、施万细胞和免疫细胞的协调转录重塑。神经元层面，PNI表现为亚型身份部分丧失和损伤反应程序激活。受损感觉神经元下调亚型定义基因，同时强烈诱导Atf3，并表达再生相关基因如Sprr1a和Gap43。Adcyap1（编码PACAP）可能促进轴突再生同时限制伤害性信号。Clcf1在损伤诱导的神经元簇中表达，可能连接外周神经元重编程与脊髓星形胶质细胞激活及中枢敏化。iPain图谱在部分慢性疼痛模型中鉴定出衰老样伤害感受器状态，清除衰老细胞可减轻小鼠疼痛相关行为，但行为改善本身并不证明转录状态可逆或稳定。非神经元细胞同样经历广泛重塑。SGCs上调Gfap、Apoe等反应性基因，下调Kcnj10等稳态基因，胆固醇生物合成基因（Hmgcs1、Fdft1）下调可能损害神经元修复的脂质支持。施万细胞表现出修复相关和压力相关状态。Il34/Csf1r介导的施万细胞–巨噬细胞通讯可能维持神经损伤后的神经炎症和慢性疼痛。免疫反应呈顺序性：急性期受损神经元分泌Ccl2和Csf1，促进Ccr2+单核细胞来源巨噬细胞浸润，这些巨噬细胞可能维持促炎性DRG微环境。Mrgprb2介导的肥大细胞激活也参与损伤后神经源性炎症和疼痛。PNI不仅是轴突损伤疾病，也是DRG内多细胞稳态的失败。
Diabetic painful neuropathy
糖尿病痛性神经病变（DPN）是糖尿病最常见的慢性并发症，在高血糖、脂代谢异常、氧化应激和微血管功能障碍等慢性代谢应激下发展。单细胞研究显示其DRG重塑模式与创伤性神经损伤不同。神经元层面，DPN相关亚群包括以Fxyd7和Atp1b1上调为特征的机械性异常性疼痛相关簇，提示离子调节异常参与机械性超敏的维持。非肽能神经元中Mrgprd异常上调可能与皮肤传入异位激活有关。Piezo2、Scn9a和Scn3a等机械敏感和电压门控离子通道表达改变可促进感觉异常。DPN的突出特征是SGC代谢功能障碍。Ugt8表达减少和半乳糖神经酰胺生物合成受损破坏脂筏完整性，削弱SGC–神经元代谢偶联，导致伤害感受器活动过度。配体–受体推断分析提示胶质细胞和神经元之间Ptn–Ncl和Mdk–Ncl信号改变。这种代谢解偶联与PNI中更典型的炎性胶质增生形成对比。人类DPN组织的空间分析显示，Nageotte结节主要由表达SPP1的卫星胶质细胞和无髓施万细胞组成，与营养不良或发芽的传入轴突相关，代表晚期多细胞DRG神经退行性重塑。免疫反应呈情境依赖性：前糖尿病小鼠中Ccr2阳性巨噬细胞可表达Trem2和Lgals3，通过半乳糖凝集素3信号延缓末端感觉轴突变性，这与某些PNI模型中促痛巨噬细胞反应不同，表明不加区分的抗炎策略可能不适用于所有神经病理性疼痛病因。
Chemotherapy-induced neuropathic pain
化疗诱导神经病理性疼痛（CINP）是多种抗肿瘤药物的常见剂量限制性不良反应，涉及线粒体功能障碍、轴突运输受损和神经免疫信号改变。单细胞研究表明CINP并非单一综合征，而是具有药物特异性的神经元和非神经元脆弱性模式。在紫杉醇诱导神经病变中，Sun等人发现多个感觉神经元亚型广泛上调Camk1d，同时Th/Slc17a8定义的C-LTMR样神经元存在显著转录组重塑。功能敲低实验提示Camk1d参与热和冷超敏，但未证明其表达或功能仅限于C-LTMR样群体。Tonello等人证明紫杉醇降低卫星胶质细胞中Timp3表达，导致涉及Mmp14和Adam17的金属蛋白酶相关信号去抑制，促进促炎微环境。紫杉醇神经病变涉及神经元亚型脆弱性和胶质微环境重塑。硼替佐米神经病变则显示不同的胶质和基质反应。Thomsen等人报道雄性小鼠在硼替佐米处理后，SGCs出现Atf3驱动的促纤维化程序，导致病理性胶原沉积从物理上压迫感觉神经元，部分与巨噬细胞–SGC串扰相关，且雌性小鼠中较少见，后者相对富集脂质代谢程序。这表明性别是CINP的重要生物学变量，不同化疗药物可能激活不同的DRG病理程序。因此，CINP是一组药物特异性病理生物学状态，可能需要机制定制的治疗策略。
Shared and etiology-specific DRG remodeling
比较PNI、DPN和CINP显示，这些疾病共享部分生物学过程，而非单一保守分子程序。细胞状态指特定细胞群体中可重复的转录组构型，而细胞状态转换需时间进程证据。大多数现有研究依赖单时间点或重复横断面采样，只能识别疾病相关细胞状态和潜在时间模式，而非直接追踪同一细胞内的转换。主要重叠发生在广泛生物学过程层面，包括神经元状态重塑、胶质稳态支持改变、情境依赖性免疫反应和细胞外基质重塑。这些细胞状态可依据细胞类型、疾病阶段和实验背景发挥适应性、适应不良或退行性功能。例如损伤相关神经元程序可能包含再生和疼痛相关成分，而人类糖尿病周围神经病变中的Nageotte结节更符合晚期神经退行性重塑而非早期或疼痛特异性机制。因此，类似转录特征在不同病因中不应被假定产生等效功能结局。病因特异性模式依然显著：PNI以神经元损伤和修复状态、反应性和代谢性SGC重塑及神经免疫细胞募集为特征；DPN与感觉编码改变、SGC脂质支持功能受损和推断的神经元–SGC信号相关；CINP表现出显著药物相关变异，包括紫杉醇后亚型选择性神经元脆弱性和金属蛋白酶失调的SGC状态，以及硼替佐米后雄性偏向的促纤维化重塑。目前对这些反应的时间协调理解仍不完整。现有证据提示PNI以早期神经元损伤反应和趋化因子诱导开始，随后是胶质和免疫重塑，而DPN中代谢、神经元和胶质异常可能并行演变。大直径有髓神经元，包括NF机械感受器和本体感受器，在疾病重点数据集中仍不如伤害感受器表征充分。PNI后出现了Nefh表达群体改变，但其对持续性疼痛的贡献尚不确定。snRNA-seq对大神经元核的改善回收尚未转化为对其疾病特异性作用的清晰理解。
Single-cell profiling of the human DRG
啮齿动物镇痛候选药物转化有限，突显了在细胞分辨率下定义人类DRG分子架构的必要性。单核RNA测序、空间转录组学、单细胞体深度RNA测序和跨物种整合研究已生成日益全面的人类DR
