《Molecular and Cellular Biochemistry》：Sialotranscriptome of Simulium pertinax and functional characterization of SpVaP: a novel recombinant simuliid-specific vasodilator
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嗜血节肢动物的唾液腺具有显著的分子多样性，反映了对吸血生活方式的进化适应以及媒介-宿主相互作用。在本研究中，研究人员对南美洲广泛分布的重要医学蚋种——Simulium pertinax 的成年雌性唾液腺转录组进行了表征。通过RNA测序和生物信息学分析，研究人员
嗜血节肢动物的唾液腺具有显著的分子多样性，反映了对吸血生活方式的进化适应以及媒介-宿主相互作用。在本研究中，研究人员对南美洲广泛分布的重要医学蚋种——Simulium pertinax 的成年雌性唾液腺转录组进行了表征。通过RNA测序和生物信息学分析，研究人员鉴定了15,708条高质量转录本，其中1,947个聚类与分泌蛋白相关，分布于23个不同的功能家族，包括消化酶、蛋白酶抑制剂、抗菌肽和止血调节剂。对选定的嗜血相关家族（包括Kunitz结构域抑制剂、Apyrases、Kazal型抑制剂、Serpins和SVEP同源物）进行的系统发育分析揭示了蚋科（simuliids）中保守的进化关系与谱系特异性多样化并存的现象。值得注意的是，SVEP（Simulium Vasodilator Erythema Protein，蚋血管扩张红斑蛋白）家族在转录组中高度代表，且似乎仅限于蚋类。鉴于其生物学作用在很大程度上尚未被表征，研究人员选择了一个新的SVEP变体进行异源表达和功能表征，并将其命名为重组Simulium pertinax血管活性蛋白（recombinant Simulium pertinax Vasoactive Protein，rSpVaP）。该重组蛋白在小鼠提睾肌小动脉中引发了血管扩张活性，并诱导了显著的足跖水肿。这些发现支持rSpVaP是蚋科中一种具有生物学活性的SVEP相关唾液血管活性蛋白，强调了其促进血餐摄取的贡献。综上所述，这些结果凸显了将转录组学分析与功能表征相结合以揭示蚋类血餐行为分子适应性的价值，增进了对媒介-宿主相互作用以及塑造唾液转录组（sialotranscriptome）的进化压力的理解。
蚋属（*Simulium*）昆虫是多种病原体的传播媒介。在巴西，*Simulium guianense*是盘尾丝虫病的主要传播媒介，而*Simulium pertinax*虽分布广泛并具有公共卫生重要性，但其唾液腺的分子组成长期缺乏系统研究。吸血节肢动物唾液腺分泌的活性分子能够调节宿主免疫与止血反应，从而促进吸血。然而，*S. pertinax*的唾液转录组（sialotranscriptome，即唾液腺中全部表达基因的集合）尚未被表征，相关分子机制仍不清楚。为此，研究人员对*S. pertinax*雌性唾液腺开展了转录组测序和功能验证，旨在解析其唾液蛋白的组成、进化与活性。该研究发表在《Molecular and Cellular Biochemistry》。
研究人员通过RNA测序、从头组装与功能注释，获得了*S. pertinax*雌性唾液腺的转录组图谱，鉴定出15,708条高质量转录本，其中1,947个聚类编码带信号肽的分泌蛋白。系统发育分析显示多个吸血相关蛋白家族存在谱系特异性多样化。研究人员选取高丰度且为蚋类特有的SVEP家族新成员SpVaP进行重组表达，并证明重组蛋白rSpVaP在小鼠体内具有血管扩张和致水肿活性，提示其参与促进血餐摄取。该研究将转录组筛选与功能表征相结合，为理解蚋类血餐适应的分子基础提供了重要依据，并建立了可供后续研究利用的转录组资源。
主要技术方法概括如下。样本采集自巴西圣保罗州Ilhabela地区，以约600只成年雌性*S. pertinax*唾液腺混合样本提取RNA；构建cDNA文库后于Illumina HiSeq 1500平台双端测序；经rnaSPAdes从头组装和Corset去冗余，利用SignalP预测信号肽并以FPKM统计分泌蛋白家族相对丰度；对Kunitz、Kazal、Serpin、Apyrase和SVEP家族进行多序列比对与邻接法系统发育分析；选取SVEP转录本构建pET-28a(+)载体，在*E. coli* BL21(DE3)中表达并纯化rSpVaP；采用圆二色谱与AlphaFold3预测结构；通过小鼠提睾肌活体显微镜和足跖水肿实验评价体内活性；统计使用双因素重复测量方差分析。
研究结果分以下几个方面。
**组装的一般特征（General aspects of the assembly）**：RNA-seq共产生22,490,995对端读段，经筛选和去除线粒体序列后保留15,708个核富集转录本。其中1,947个聚类预测编码具有信号肽的分泌蛋白，约占12.4%。功能注释显示这些转录本涉及多种生物学过程和分子功能，反映唾液腺转录组的复杂性。
**选定*S. pertinax*家族的功能分类与系统发育分析（Functional classification and phylogenetic analysis of selected *S. pertinax* families）**：对与血餐相关的蛋白家族进行了系统发育分析，结果表明不同家族中同时存在跨物种保守关系和蚋种内谱系分化。
**Kunitz结构域蛋白酶抑制剂（Kunitz-domain protease inhibitors）**：10条*S. pertinax* Kunitz序列分布于多个分支，其中一条与已表征的Simukunin聚在一起，另一条与SV-170相关，同时还存在蚋种内特异分支，提示该家族在种内发生过复制与分化。
**Kazal型蛋白酶抑制剂（Kazal-type protease inhibitors）**：*S. pertinax* Kazal序列与蚊类同源物有32–42%同一性，系统发育未形成严格按物种分离的格局，而是呈现多个近缘序列聚集，提示存在基因复制和多样化。
**Serpin（Serpin）**：大部分*S. pertinax* Serpin序列聚集在物种富集分支中，与伊蚊和库蚊同源物分开；其中一条序列位于分支外，表明该物种的Serpin库可能包含多个分歧谱系。
**Apyrase（Apyrase）**：鉴定出5条预测为分泌型的Apyrase序列，缺少GPI锚定位点。系统发育显示部分序列与其他蚋类保守聚集，其余序列分歧较大，说明Apyrase在*S. pertinax*中也存在多样化。
**SVEP血管扩张家族（SVEP vasodilator family）**：发现3个完整的SVEP同源序列，形成*S. pertinax*特异的聚类，并与*S. vittatum*的SVEP同源物相关。SVEP家族在蚋类中广泛多样化且局限于蚋类，提示其具有谱系特异性功能。
**SpVaP的克隆与表达（SpVaP cloning and expression）**：选择高丰度的SVEP转录本SpVaP，其前体含152个氨基酸残基，成熟蛋白为132个残基。重组表达后获得可溶性约15 kDa蛋白，经SDS-PAGE、Western blot和质谱确认，肽段覆盖率达67%。
**圆二色谱与结构模型（Circular dichroism and structural model）**：圆二色谱显示rSpVaP不含α-螺旋，约50%为β-折叠，与AlphaFold3预测的β-三叶草折叠模型一致。模型包含12条β-链和Cys8-Cys130二硫键，二级结构预测与实验数据吻合。
**rSpVaP的活体显微镜分析（Intravital microscopy analysis of rSpVaP）**：将rSpVaP（8.6 μM）局部施加于小鼠提睾肌后，小动脉直径在5分钟内显著增加，呈时间依赖性；rGST和缓冲液对照无此效应，表明血管舒张作用为rSpVaP特异性。
**致水肿活性（Edematogenic activity）**：将rSpVaP（12 μM）注射入小鼠足跖后，足厚度在30分钟至6小时内显著增加，24小时恢复至基线；对照组无显著变化，表明rSpVaP可诱导急性水肿反应。
讨论部分指出，该研究首次描绘了*S. pertinax*唾液腺转录组，并关联了分泌蛋白库的进化与功能证据。但FPKM基于单一混合雌性样本，仅代表数据集内的相对丰度。系统发育中部分节点支持率较低，限制了对多样化事件顺序的精确推断。Kunitz家族中与已知功能蛋白的相近关系提示候选活性，但序列相似不足以预测功能；Kazal和Serpin在早期蚋类转录组中未被报道，可能反映物种差异或注释灵敏度。Apyrase虽预测为分泌型，但未测定酶活性。SVEP家族是蚋类特有的血管活性蛋白，rSpVaP在体内的血管扩张和致水肿作用支持其促进吸血，然而单浓度设计无法推导效力和剂量依赖关系。总体而言，该研究建立了*S. pertinax*的参考转录组资源，并直接证明其SVEP家族成员在宿主微循环中具有生物活性。
结论翻译如下：本研究首次对*S. pertinax*的唾液转录组进行了表征，为这一研究较少的南美蚋种的分子库提供了重要见解。研究人员的分析描绘了分泌蛋白库的图谱，揭示了包括消化酶、丝氨酸蛋白酶抑制剂、抗菌肽和参与宿主止血调节的蛋白在内的复杂功能家族阵列。系统发育分析揭示了保守的进化关系以及*S. pertinax*选定唾液蛋白家族中谱系相关的序列多样化，突出了其唾液库的进化多样性，但并非所有家族都严格按物种分离。作为功能概念验证，研究人员成功表达并表征了rSpVaP，通过体内实验确认了其在急性反应期的显著血管扩张活性和致水肿效应。总体而言，这项工作展示了将转录组筛选与分子克隆和功能验证相结合的价值。rSpVaP的表征是阐明*S. pertinax*唾液蛋白生物学作用的第一步，并为未来研究其在媒介-宿主相互作用和血餐分子基础中的角色建立了框架。
