使用含载脂蛋白E3的纳米盘靶向溶酶体膜蛋白酸性鞘磷脂酶

《The Journal of Membrane Biology》：Targeting of Acid Sphingomyelinase, a Lysosomal Membrane Protein, Using Apolipoprotein E3-containing Nanodiscs

　　

研究人员开发了一种基于纳米盘（nanodisc, ND）的平台，将重组酸性鞘磷脂酶（acid sphingomyelinase, ASM）嵌入由载脂蛋白E3（apolipoprotein E3, apoE3）围绕的磷脂双层中，以实现向溶酶体的靶向递送。研究人员设计了一种融合蛋白，包含ASM的关键催化片段，其一端带有跨膜螺旋（transmembrane helix, TM-ASMcat）。纯化的TM-ASMcat与磷脂及apoE3的N端（N-terminal, NT）结构域重组，以促进ND的形成（TM-ASMcat-ND）。理化表征显示，制备物中同时存在TM-ASMcat（35 kDa）和apoE3^NT（24 kDa），并形成了大分子复合物（400–600 kDa）。TM-ASMcat-ND的透射电子显微镜观察显示其呈盘状复合物（长轴/短轴分别为30.9 ± 11.9/8.6 ± 2.0 nm），而原子力显微镜显示ND高度约为14 nm。TM-ASMcat-ND在pH 5条件下具有显著的水解鞘磷脂的能力。经TM-ASMcat-ND处理的胶质母细胞瘤细胞的LC-MS/MS分析显示，与PBS处理的细胞相比，总鞘磷脂含量显著降低（22.3%）。鞘脂组学分析显示，与空ND处理的细胞相比，特定鞘磷脂种类呈下降趋势。免疫荧光分析显示核周囊泡中ASM与apoE3及LysoTracker共定位，表明TM-ASMcat-ND成功靶向溶酶体。综上，这些数据表明TM-ASMcat已嵌入ND中，并在溶液中和细胞内保留催化活性。该发现具有治疗尼曼-匹克病A型和B型中ASM缺乏症的潜力，这两种疾病是以鞘磷脂蓄积为特征的溶酶体贮积症。

论文解读：基于apoE3纳米盘的酸性鞘磷脂酶靶向递送研究

酸性鞘磷脂酶（acid sphingomyelinase, ASM）是一种溶酶体膜结合蛋白，负责将鞘磷脂（sphingomyelin, SM）水解为神经酰胺和磷酸胆碱。编码ASM的基因SMPD1缺陷可导致尼曼-匹克病A型（NPD-A）、B型（NPD-B）及A/B型（NPD-A/B），这些疾病属于溶酶体贮积症（lysosomal storage diseases, LSDs），以鞘磷脂在溶酶体内异常蓄积为特征。目前已有重组ASM（Olipudase alfa）用于非神经病变型NPD-B的酶替代疗法（enzyme replacement therapy, ERT），但在应用层面仍存在挑战，且对ASM膜转运、靶向递送及ASM-脂质相互作用的机制理解尚不充分。为此，研究人员设计了一种基于纳米盘（nanodisc, ND）的新型递送平台：将含跨膜锚定的ASM催化片段嵌入磷脂双层，并利用载脂蛋白E3（apolipoprotein E3, apoE3）作为低密度脂蛋白受体（low-density lipoprotein receptor, LDLr）配体，通过受体介导的内吞途径将ASM靶向递送至溶酶体。该研究发表于《The Journal of Membrane Biology》。

主要关键技术方法包括：将包含SPC来源跨膜螺旋、柔性连接肽和ASM催化区（残基319–579）的融合蛋白TM-ASMcat在大肠杆菌中表达并纯化；采用胆酸盐透析法将TM-ASMcat与磷脂（POPC）及双(单酰基甘油)磷酸酯（bis(monoacylglycero)phosphate, BMP）和apoE3的N端结构域（apoE3^NT）组装成ND；通过密度梯度超速离心纯化；利用非变性PAGE、透射电子显微镜（TEM）、原子力显微镜（AFM）和动态光散射（DLS）进行理化表征；用pull-down和Western blot验证组分；采用Amplex Red试剂盒测定酶活性；以人胶质母细胞瘤（GBM）A-172细胞（ATCC）为模型，通过免疫荧光和共聚焦显微镜观察细胞摄取与溶酶体定位；以液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）进行鞘脂组学分析。

研究结果部分：

Design of TM-ASMcat Construct：研究人员设计了融合蛋白TM-ASMcat，包含SPC跨膜螺旋（SPC-TM）、(G₄S)₂连接肽、ASM催化区残基319–579及六聚组氨酸标签（H6）。经ColabFold 2预测的结构与ASM晶体结构（PDB #5JG8）比较，整体折叠可能保持。

Assembly of TM-ASMcat-ND Platform：通过去垢剂去除自发组装形成TM-ASMcat-ND。密度梯度超速离心后，Western blot显示顶层组分同时存在TM-ASMcat（35 kDa）和apoE3^NT（24 kDa）。非变性PAGE显示形成约440 kDa和约700 kDa的大复合物。抗apoE抗体pull-down后，抗ASM抗体检测到35 kDa条带，证实TM-ASMcat与ND相关。

Physicochemical Characterization of TM-ASMcat-ND：TEM显示TM-ASMcat-ND为盘状复合物，长轴/短轴为30.9 ± 11.9/8.6 ± 2.0 nm；空ND为对称分布。AFM显示TM-ASMcat-ND高度约14.0 ± 0.4 nm，显著高于空ND的4.3 ± 0.1 nm，提示TM-ASMcat通过跨膜螺旋插入脂双层。DLS显示TM-ASMcat-ND呈双峰分布，平均直径分别为78.2 ± 6.7 nm和365.5 ± 34.1 nm，空ND为单峰（141.8 ± 2.4 nm）。

Retention of Catalytic Activity in TM-ASMcat-ND：在pH 5.0条件下，TM-ASMcat-ND的鞘磷脂酶活性（52.4 ± 34.4 × 10³ RFU/mg protein）显著高于游离TM-ASMcat（18.6 ± 9.6 × 10³ RFU/mg protein）和空ND（689.7 ± 450.9 RFU/mg protein），表明嵌入ND后保留催化活性。

LDLr Binding Ability of TM-ASMcat-ND：采用可溶性LDLr（sLDLr/LA3-LA6/c-myc）进行共免疫沉淀，结果显示TM-ASMcat-ND和空ND均能与sLDLr结合，且TM-ASMcat-ND复合物中可检测到ASM，说明嵌入TM-ASMcat不影响apoE3^NT的LDLr结合能力。

Cellular Uptake and Lysosomal Localization of TM-ASMcat-ND in GBM Cells：免疫荧光显示，GBM细胞经TM-ASMcat-ND处理后，ASM与apoE3共定位（Pearson’s R = 0.81），并与LysoTracker共定位于核周囊泡（Pearson’s R = 0.92），表明TM-ASMcat-ND通过LDLr介导的内吞被摄取并递送至溶酶体。

TM-ASMcat-ND decreases SM content in GBM cells：鞘脂组学分析显示，与PBS处理相比，TM-ASMcat-ND处理的细胞总SM含量显著降低22.3%（验证+异构体）和22.8%（仅验证种）；与空ND相比，部分SM种类呈下降趋势，其中SM t33:2_14.59 | t14:2_n19:0显著降低（P = 0.023）。提示外源递送的ASM在细胞内发挥催化功能，降低SM水平。

讨论部分指出，含apoE3^NT的ND具有双重功能：一方面作为脂双层支架稳定插入ASM，提供保护性环境；另一方面通过LDLr介导内吞实现靶向递送。TM螺旋不仅锚定ASM至ND，也可能在溶酶体膜上重新锚定。BMP提供了类溶酶体膜环境。该平台具有治疗NPD-A/B的潜力，并可能扩展至其他LSDs。研究结论可翻译为：综上，数据表明TM-ASMcat已嵌入ND中，并在溶液中和细胞内保留催化活性。该发现具有治疗尼曼-匹克病A型和B型中ASM缺乏症的潜力，这两种疾病是以鞘磷脂蓄积为特征的溶酶体贮积症。