膳食调节小鼠长期暴露于农药混合物的代谢和肝脏反应

《Archives of Toxicology》：Diet modulates metabolic and hepatic responses to chronic pesticide mixture exposure in mice

　　

长期通过膳食接触农药混合物十分普遍，然而其联合代谢效应及与饮食因素的相互作用仍不明确。研究人员确定了人类暴露中常见的四种农药（抑霉唑[IMZ]、噻菌灵[TBZ]、啶酰菌胺[BSC]、高效氯氟氰菊酯[LCT]），并利用人肝细胞以及饲喂标准饲料或西方饮食的雄性小鼠，评估了这些农药联合作用对肝脏代谢和代谢稳态的影响。研究人员发现，该农药混合物可在人肝细胞中诱导代谢紊乱。此外，在饲料喂养的小鼠中，该农药混合物改变了肝脏基因表达，并加剧了西方饮食诱导的葡萄糖耐受不良、空腹高血糖和胰岛素抵抗，但未影响体重或肝脏脂肪变性。这些发现表明，饮食背景可影响农药混合物的代谢后果，强调在评估环境污染物风险时需要考虑营养状态。研究人员的结果表明，处于参考剂量的农药混合物可能促进代谢失调，尤其是在致肥胖饮食条件下。

**膳食调节小鼠长期暴露于农药混合物的代谢和肝脏反应——论文解读**

**一、研究背景**

现代农业中农药的大量使用导致空气、土壤、水体及食品的广泛污染，人类通过多种途径持续暴露于这些外源性化学物质。流行病学研究已建立农药职业暴露与肥胖及2型糖尿病（T2D）发病率升高之间的关联，膳食农药暴露谱也被发现与普通人群的T2D风险相关。相反，有机食品消费（通常农药残留水平较低）与代谢综合征、肥胖及T2D风险降低相关。尽管肥胖和T2D是代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）的关键危险因素，且肝脏是污染物代谢的主要器官，但农药暴露与MASLD发生之间的关联仍未得到充分阐明。

机制研究表明，多种农药可干扰参与代谢调节和肝功能的相关通路，尤其是通过与调节脂质和葡萄糖代谢、炎症及解毒过程的肝脏核受体相互作用。此外，多项体外和体内研究报道了农药的促氧化特性。实验研究进一步表明，单一农药可破坏整体代谢稳态并促进肝脏脂肪变性。

膳食途径的多农药残留暴露十分普遍，消费者长期暴露于低于法规限值的复杂混合物。然而，多种农药同时存在可能产生加性甚至大于加性的效应，这是单一化合物评估所无法预测的。尽管近年来临床前研究支持混合农药可改变代谢稳态和肝功能，但长期膳食暴露于现实农药混合物对代谢的影响及与膳食因素的相互作用仍不清楚。

**二、研究内容**

基于NutriNet-Santé队列中鉴定的暴露谱，研究人员首先通过体外实验筛选，确定了四种联合使用时可在人肝细胞中诱导代谢紊乱的农药（IMZ、TBZ、BSC、LCT）。随后，在标准饲料（CD）和西方饮食（WD）中掺入这四种农药，使小鼠在20周内暴露于两种参考剂量——人类每日可接受摄入量（ADI）或其十倍剂量（10ADI，即1/10未观察到有害作用水平[NOAEL]）。研究旨在评估这一现实农药混合物在毒理学参考剂量下对肝脏代谢和能量稳态的慢性影响，以及其与膳食因素之间的潜在相互作用。该研究成果发表于《Archives of Toxicology》。

**三、主要关键技术方法**

研究人员使用了以下主要技术方法：（1）采用永生化人肝细胞（IHH）进行体外筛选实验，包括核受体报告基因检测法评估组成型雄烷受体（CAR）和孕烷X受体（PXR）激活；微阵列技术进行全基因组表达分析；气相色谱-火焰离子化检测法（GC-FID）定量细胞内甘油三酯含量；海马XFe分析仪（Seahorse XF）测定线粒体耗氧率（OCR）。（2）体内研究使用8周龄雄性C57BL/6小鼠（Janvier Labs），随机分为CD或WD喂养组，每组再分为对照、ADI和10ADI暴露亚组（每组n=12），饲料中农药浓度经液相色谱-质谱联用（LC-MS）验证。（3）肝脏转录组分析采用RNA测序（RNA-seq）技术。（4）采用高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）和气相色谱-串联质谱（GC-MS/MS）定量肝脏和尿液中的母体农药及其代谢物。（5）通过口服葡萄糖耐量试验（OGTT）评估全身葡萄糖稳态，并利用组织学和免疫荧光染色分析胰腺内分泌细胞群。

**四、研究结果**

**1. 候选农药的筛选**

研究人员利用NutriNet-Santé队列中表征的法国成年人膳食农药暴露谱，在暴露最高的“聚类3”中按估计摄入量对25种常用农药进行排序，保留相对平均差异>1.5的12种候选农药。随后根据作用机制与氧化应激和脂质代谢的关联性筛选出9种，排除欧盟禁用农药后保留6种。最终结合该队列中与T2D风险正相关的报道，确定了包含四种杀菌剂（嘧菌酯[AZX]、BSC、IMZ、TBZ）和一种杀虫剂（LCT）的候选清单。体外细胞活力实验显示AZX在72小时暴露后即使在5 μM低浓度下也产生细胞毒性，因此被排除。最终选择IMZ、TBZ、BSC和LCT四种农药，在30 μM浓度（急性和慢性暴露的最高非细胞毒性剂量）下进行后续实验。

**2. 四种农药混合物对肝脏代谢的体外影响**

将IHH细胞暴露于含四种农药各30 μM的混合物（ITBL）24小时，发现CYP2B6、CYP3A4和CYP1A1的表达显著升高，SREBP1c表达亦有增加。核受体报告基因检测证实了CAR和PXR的激活，但混合物虽诱导CYP1A1表达却未在报告基因检测中激活芳香烃受体（AhR），提示AhR激动活性可能需要代谢激活或存在非AhR依赖性信号通路。微阵列分析显示，暴露组与未处理组的基因表达谱在主成分分析（PCA）中明显区分，共有4205个差异表达基因（DEGs，p<0.05，倍数变化>1.5）。聚类分析鉴定出两个基因簇：簇1基因下调，与细胞周期过程相关，富含E2F1/4、MYC和TP53靶基因；簇2基因上调，主要为SP1、STAT3、TP53和ATF4转录因子的靶基因，相关生物学功能包括“对营养水平的响应”、“核受体meta通路”、“细胞内信号转导的负调控”和“对内质网应激的响应”。混合物暴露显著上调大量参与外源物代谢（SULT1C2、CYP3A5、UGT2B7、CYP2B6、POR）和脂质代谢（PNPLA3、SCD1、SREBF1、MSMO1、PPARα、HADHB）的基因。此外，混合物暴露10天后细胞内甘油三酯含量显著升高，24小时暴露后基础呼吸、最大呼吸和ATP产生均显著增加，提示线粒体对脂质积累产生了代偿性反应而非脂毒性损伤。

**3. 小鼠长期膳食暴露于四种农药混合物的影响**

在CD喂养小鼠中，农药混合物暴露导致肝脏转录组发生显著变化：ADI暴露组有607个基因上调和611个基因下调，10ADI暴露组有904个基因上调和994个基因下调。层次聚类鉴定出两个基因簇，簇1上调基因与脂肪酸代谢、氨基酸代谢和细胞呼吸相关，主要富集于过氧化物酶体增殖物激活受体α（PPARα）靶基因；簇2下调基因主要涉及RNA和蛋白质加工。尽管肝脏基因表达改变显著，但暴露未影响肝脏重量，未诱导明显肝损伤，仅观察到脂肪变性评分分布略有变化，肝脏甘油三酯含量呈一致但未达显著水平的升高趋势。相反，WD喂养小鼠暴露于农药混合物后，肝脏转录组PCA未与未暴露组区分，差异表达基因数量无明显变化，未影响WD诱导的肝脏脂肪变性。

**4. 肝脏农药浓度和尿液代谢物分析**

肝脏中IMZ、TBZ和BSC的浓度在CD喂养小鼠中显著高于相同暴露水平的WD喂养小鼠，提示膳食影响农药的生物利用度、分布或肝脏代谢。相反，LCT仅在暴露的WD喂养小鼠肝脏中被检测到。尿液代谢物分析显示，CD暴露小鼠中检出更多或更高水平的农药代谢物，包括I相代谢物（啶酰菌胺5-羟基、噻菌灵5-羟基）和II相代谢物（葡萄糖醛酸和硫酸结合物）。肝脏外源物代谢酶基因表达分析显示，CD暴露小鼠中7个基因表达显著增加，而WD暴露小鼠仅2个。这些结果不支持WD小鼠存在增强的肝脏代谢，而更提示肝外组织蓄积。

**5. 全身葡萄糖稳态**

CD喂养小鼠在暴露18周后，葡萄糖耐量、空腹血糖、胰岛素水平和胰岛素抵抗稳态模型评估指数（HOMA-IR）均未受农药混合物暴露影响。然而，WD喂养小鼠暴露于10ADI农药混合物后，表现出显著加重的葡萄糖不耐受、空腹高血糖、高胰岛素血症和HOMA-IR升高。胰腺组织学分析显示，尽管WD喂养小鼠的胰岛数量和内分泌面积显著高于CD喂养小鼠，但农药暴露未进一步改变这些参数，β细胞和α细胞面积在暴露与未暴露WD小鼠间也无显著差异。这表明WD暴露于农药混合物的小鼠，胰腺内分泌未能代偿农药诱导的葡萄糖不耐受和胰岛素抵抗。

**五、讨论与结论**

本研究的创新之处在于：（1）整合人类流行病学暴露谱指导农药选择；（2）利用多种体外检测鉴定可影响肝细胞代谢过程的农药混合物；（3）通过体内研究评估四种农药混合物在毒理学参考剂量下的效应及膳食组成的影响。研究发现，农药混合物的代谢效应并非一致，而是依赖于膳食类型，凸显了营养背景在塑造毒理学结果中的作用。

在CD喂养小鼠中，农药混合物暴露虽未引起明显表型改变，但诱导了显著的肝脏基因表达变化，以脂肪酸代谢过程为主要富集通路，支持混合物具有促脂肪变性潜能。20周的暴露时间可能不足以诱导可检测的表型改变，既往研究曾报道6个月暴露后才出现脂肪变性。在WD喂养小鼠中，农药混合物虽未产生肝脏表型和基因组改变，但在10ADI剂量下加剧了WD诱导的糖尿病症状，包括空腹高血糖、葡萄糖耐受不良和胰岛素抵抗。这与近期研究一致，提示高脂膳食摄入可能增强农药暴露的代谢效应。

WD喂养小鼠肝脏中母体农药浓度较低、尿液代谢物浓度减少且外源物代谢酶表达水平不变，提示肝外蓄积而非肝脏代谢增强。鉴于农药的亲脂性，脂肪组织可能是其蓄积靶点。研究还发现，农药混合物暴露未改变肝脏中参与糖异生、糖原合成、葡萄糖转运和胰岛素信号的基因表达，提示肝脏可能不是农药混合物影响WD小鼠葡萄糖代谢的主要靶组织，骨骼肌和/或脂肪组织的葡萄糖摄取是否受损有待确定。

WD喂养且暴露于农药混合物的小鼠，空腹高血糖和空腹胰岛素升高均比未暴露小鼠更显著，但胰岛数量和内分泌质量未增加，α和β细胞数量也无变化，提示内分泌胰腺未能代偿农药诱导的胰岛素抵抗。这可能与污染物靶向胰腺β细胞有关，β细胞无法充分增加胰岛素分泌以应对需求。

总之，该研究表明，慢性膳食暴露于这一现实农药混合物中各农药的参考剂量，可在CD喂养小鼠中引起显著的肝脏基因表达改变，并加剧WD诱导的葡萄糖稳态紊乱。这是少数证明膳食背景以膳食特异性方式显著改变对农药混合物的肝脏转录组和代谢反应的研究之一。CD和WD小鼠之间的差异性反应强调了环境污染物与膳食因素之间复杂的交互作用，以及评估农药混合物代谢效应时考虑膳食背景的重要性。尽管从小鼠外推到人类存在局限，但研究结果表明，对农药暴露的敏感性可能因代谢状态而异。鉴于保障消费者安全的毒理学参考值是基于单一农药定义的，这些参考值在农药混合物联合暴露时的适用性值得重新审视。

研究的局限性包括：未鉴定农药混合物影响葡萄糖稳态的机制，未确定WD小鼠中农药蓄积的具体组织，未比较混合物与各单一农药的效应，且未评估雌性小鼠中的暴露效应。鉴于肝脏能量和外源物代谢具有高度性别二态性，该农药混合物可能具有性别特异性健康效应。