《Archives of Virology》：Molecular characterization of a novel partitivirus harboring an additional third dsRNA segment from Trichoderma harzianum
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**摘要**
研究人员报道了从哈茨木霉（*Trichoderma harzianum*）NFCF092菌株中鉴定到的一种新型partitivirus的完整基因组序列，将其命名为哈茨木霉partitivirus 4（*Trichoderma harzianum
**摘要**
研究人员报道了从哈茨木霉（*Trichoderma harzianum*）NFCF092菌株中鉴定到的一种新型partitivirus的完整基因组序列，将其命名为哈茨木霉partitivirus 4（*Trichoderma harzianum* partitivirus 4，ThPV4）。与Partitiviridae科的典型成员不同——该科典型成员具有由两个双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）片段组成的双分体基因组，分别编码RNA依赖性RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRP）和衣壳蛋白（capsid protein，CP）——ThPV4携带第三个编码未知功能蛋白的dsRNA片段。其完整基因组由dsRNA1（1,950 bp；编码RdRP）、dsRNA2（1,772 bp；编码CP）和dsRNA3（1,629 bp；编码未知功能蛋白）组成。序列分析表明，每个片段均含有一个单一开放阅读框（open reading frame，ORF）。RdRP推导氨基酸序列与*Trichoderma gamsii* alphapartitivirus 1具有最高相似性（90.5%同一性）。基于RdRP的系统发育分析表明，ThPV4聚在Partitiviridae科Alphapartitivirus属内。据研究人员所知，ThPV4是从*T. harzianum*中鉴定到的首个携带额外、保守的第三个dsRNA片段的Alphapartitivirus属成员。
**论文解读**
**一、研究背景与科学问题**
木霉属（*Trichoderma*）真菌是一类广泛分布于土壤中的丝状真菌，在工业酶生产、植物促生长以及植物病原真菌生物防治等领域具有重要经济价值。然而，包括*Trichoderma harzianum*在内的某些木霉物种，可导致双孢蘑菇（*Agaricus bisporus*）和香菇（*Lentinula edodes*）发生绿霉病，造成显著经济损失。真菌病毒（mycovirus）在真菌主要分类群中广泛分布，近年来木霉属真菌中已报道了多种真菌病毒，分别归属于Partitiviridae、Hypoviridae、Totiviridae、Fusagraviridae、Alternaviridae、Ambiguiviridae和Polymycoviridae等国际病毒分类委员会（ICTV）认可的病毒科，此外还有一些尚未分类的真菌病毒。
Partitiviridae科病毒具有双分体dsRNA基因组，两个片段分别编码RNA依赖性RNA聚合酶（RdRP）和衣壳蛋白（CP），每个片段长度约为1.4至2.4 kb。该科包含五个属：Alphapartitivirus、Betapartitivirus、Gammapartitivirus、Deltapartitivirus和Cryspovirus。虽然双分体基因组结构是Partitiviridae科的典型特征，但已有部分partitivirus被报道携带除核心RdRP和CP编码片段之外的额外dsRNA片段。这些额外片段被解释为基因组必需组分或卫星/缺陷型元件，但其进化起源和生物学功能尚待阐明。在这一背景下，研究人员对感染*T. harzianum* NFCF092菌株的新型partitivirus进行了鉴定和分子表征，该病毒被命名为哈茨木霉partitivirus 4（ThPV4）。除典型编码RdRP和CP的片段外，ThPV4还携带第三个功能未知的额外dsRNA片段，这在Partitiviridae科中较为特殊。
**二、研究内容与主要结论**
研究人员从*T. harzianum* NFCF092菌株中鉴定并完整测序了ThPV4的基因组。该病毒基因组由三个dsRNA片段组成：dsRNA1（1,950 bp，编码592个氨基酸的RdRP）、dsRNA2（1,772 bp，编码487个氨基酸的CP）和dsRNA3（1,629 bp，编码455个氨基酸的未知功能蛋白）。序列分析表明每个片段含有单一ORF，具有典型的5′和3′非翻译区（untranslated region，UTR）。RdRP序列与*Trichoderma gamsii* alphapartitivirus 1（TgAPV1）相似性最高（90.5%氨基酸同一性），其次为*Sclerotinia sclerotiorum* alphapartitivirus 1（81.8%）和*Heterobasidion* partitivirus 21（71.0%）。RdRP中保守基序（DWSGFD基序和催化性GDD三联体）的存在得到确认。CP序列也与TgAPV1最相近（77.3%同一性）。基于RdRP和CP的系统发育分析均表明ThPV4聚类在Alphapartitivirus属内，与TgAPV1形成高支持度的进化分支。dsRNA3编码的蛋白与已分类的partitivirus蛋白均无相似性，其最接近的匹配是先前在木霉病毒组（virome）调查中发现的未表征病毒序列（39.2%同一性）。
**三、关键技术方法**
研究人员从*T. harzianum* NFCF092菌株中提取dsRNA后，采用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，并通过dsRNA特异性RNase III敏感性及S1核酸酶抗性实验验证其dsRNA性质。随后构建配对末端cDNA文库，在Illumina HiSeq 2500平台上进行高通量测序，将所得读段组装成重叠群（contig）并利用BLAST搜索比对数据库。通过RT-PCR和Northern blot杂交验证三个片段的存在，采用cDNA末端快速扩增（RACE）确定各片段5′和3′末端序列。对三个dsRNA片段进行至少三次独立测序以保证序列准确性。基于RdRP和CP氨基酸序列，使用MEGA 11软件通过最大似然法构建系统发育树，并以1,000次自举重复评估分支支持度。
**四、研究结果**
**菌落形态观察与dsRNA片段鉴定。**将从*T. harzianum* NFCF092菌株中提取的核酸进行1%琼脂糖凝胶电泳，检测到约2.0、1.8和1.6 kb的三条明显条带，经RNase III敏感性及S1核酸酶抗性实验确认为dsRNA性质。将携带ThPV4的菌株与ThPV4-free等基因菌株在PDA培养基上25°C培养7天后进行菌落形态比较，未观察到明显差异。
**基因组结构分析。**通过测序和RACE确定了ThPV4基因组由三个dsRNA片段组成：dsRNA1（1,950 bp，GC含量41%）、dsRNA2（1,772 bp，GC含量43%）和dsRNA3（1,629 bp，GC含量42%）。每个片段含一个单一ORF，dsRNA1的ORF1（第96?1,874位核苷酸）编码592个氨基酸的RdRP，dsRNA2的ORF2（第76?1,539位核苷酸）编码487个氨基酸的CP，dsRNA3的ORF3（第71?1,438位核苷酸）编码455个氨基酸的未知功能蛋白。三个片段的5′末端非翻译区在第29?74位之间存在高度保守的核苷酸序列（79.6%序列同一性），但5′末端本身与其它alphapartitivirus的GAWNW保守序列不同，这一保守的5′末端序列提示RNA3可能与dsRNA1和dsRNA2共同复制。
**序列相似性分析。**BlastP分析显示，ThPV4的RdRP与TgAPV1的RdRP最相近（90.5%氨基酸同一性，536/592 aa，查询覆盖率100%），其后依次为*Sclerotinia sclerotiorum* alphapartitivirus 1（81.8%）和*Heterobasidion* partitivirus 21（71.0%）。CP序列与TgAPV1最相近（77.3%同一性，查询覆盖率97%）。dsRNA3编码的蛋白与任何已分类partitivirus蛋白均无相似性，其最接近匹配为木霉病毒组调查中发现的未表征病毒序列（39.2%同一性，查询覆盖率100%）。
**系统发育分析。**基于RdRP氨基酸序列以最大似然法构建系统发育树，结果显示ThPV4聚在Alphapartitivirus属内，与TgAPV1形成高支持度的亲缘分支。基于CP构建的系统发育树获得相同拓扑结构。
**病毒粒子共纯化检测。**经超速离心和蔗糖密度梯度离心部分纯化病毒粒子后，在SDS-PAGE中检测到约54 kDa的衣壳蛋白条带，且随纯化步骤推进该条带逐渐增强。从相应纯化病毒组分中提取dsRNA进行琼脂糖凝胶电泳，仍可检测到约2.0、1.8和1.6 kb的三条dsRNA片段，表明dsRNA3与病毒粒子结合存在。
**五、讨论与结论**
与典型partitivirus的双分体基因组不同，已有若干partitivirus被报道携带额外dsRNA片段。例如，*Aspergillus flavus* partitivirus 1（AfPV1）中因dsRNA3携带自身ORF而被定义为基因组片段，而后续发现的与AfPV1相关的无ORF dsRNA则被定性为卫星RNA。与AfPV1的第三个片段类似，ThPV4的dsRNA3携带一个完整的ORF（编码455个氨基酸蛋白），且具有与dsRNA1和dsRNA2相似的保守5′末端基序。此外，dsRNA3与部分纯化的病毒粒子级分共存。因此，研究人员认为dsRNA3很可能是基因组组分，但dsRNA3究竟是必需基因组元件还是类卫星元件，仍需进一步研究。
**结论。**基因组结构、分子特性和系统发育关系表明，来自*T. harzianum* NFCF092菌株的该病毒是Alphapartitivirus属的一个新成员，命名为*Trichoderma harzianum* partitivirus 4（ThPV4）。据研究人员所知，ThPV4是首次在*Trichoderma harzianum*中报道的携带额外第三个dsRNA片段的Alphapartitivirus属成员。该发现扩展了对Partitiviridae科基因组结构多样性的认知，为进一步深入研究partitivirus额外基因组片段的进化起源与生物学功能提供了新的案例。该论文发表于《Archives of Virology》。
