皮质类器官的体积电子显微镜技术：区域识别、连接组重建及细胞器分割的方法

《Cellular and Molecular Neurobiology》：Volume Electron Microscopy of Cortical Organoids: Methods for Region Identification, Connectome Reconstruction, and Organelle Segmentation

　　

摘要

体积电子显微镜（vEM）已成为神经回路3D超微结构分析的强大工具，但其在大脑类器官中的应用仍然有限，特别是在连接组学研究方面。在这里，我们建立了一套全面且可扩展的工作流程，将vEM应用于人类皮质类器官，整合了相关光镜和电镜技术、大面积扫描电子显微镜（SEM）马赛克成像、聚焦离子束电子显微镜（FIB-SEM）以及透射电子显微镜（TEM）验证。通过系统比较两种常用的包埋方法，我们发现DeFelipe和Fairén（1993年）以及Cano-Astorga等人（2024a年）的方法与甲苯胺蓝染色的半薄切片具有最佳兼容性，能够实现可靠的突触分割和神经突追踪。相比之下，Deerinck的方法（2010年）虽然提高了膜对比度，但限制了突触后密度的可视化。通过对皮质类器官中类似神经纤维区域的FIB-SEM成像，我们成功实现了突触、神经突和细胞内细胞器的精准3D重建，从而能够定量评估突触接合面、神经突轨迹以及不同细胞区室中的细胞器分布。总之，我们的结果首次证明了在纳米分辨率下对人类皮质类器官进行微连接组学重建的可行性。这一方法论框架扩展了vEM在类器官系统中的应用范围，并为未来关于人类大脑发育、疾病建模以及在突触和亚细胞水平上的治疗评估研究奠定了坚实的基础。

图形摘要

基于vEM的人类皮质类器官微连接组学分析工作流程：首先对皮质类器官进行样本制备、树脂包埋和半薄/超薄切片处理，然后利用大面积SEM马赛克成像技术确定感兴趣的区域以进行FIB-SEM靶向观察。超微结构观察结果通过TEM独立验证，从而建立了一套可扩展的流程，用于人类大脑类器官的连接组重建和亚细胞分析。该图像由BioRender生成。

体积电子显微镜（vEM）已成为神经回路3D超微结构分析的强大工具，但其在大脑类器官中的应用仍然有限，尤其是在连接组学研究方面。在这里，我们建立了一套全面且可扩展的工作流程，将vEM应用于人类皮质类器官，整合了相关光镜和电镜技术、大面积扫描电子显微镜（SEM）马赛克成像、聚焦离子束电子显微镜（FIB-SEM）以及透射电子显微镜（TEM）验证。通过系统比较两种常用的包埋方法，我们发现DeFelipe和Fairén（1993年）以及Cano-Astorga等人（2024a年）的方法与甲苯胺蓝染色的半薄切片具有最佳兼容性，能够实现可靠的突触分割和神经突追踪。相比之下，Deerinck的方法（2010年）虽然提高了膜对比度，但限制了突触后密度的可视化。通过对皮质类器官中类似神经纤维区域的FIB-SEM成像，我们成功实现了突触、神经突和细胞内细胞器的精准3D重建，从而能够定量评估突触接合面、神经突轨迹以及不同细胞区室中的细胞器分布。总之，我们的结果首次证明了在纳米分辨率下对人类皮质类器官进行微连接组学重建的可行性。这一方法论框架扩展了vEM在类器官系统中的应用范围，并为未来关于人类大脑发育、疾病建模以及在突触和亚细胞水平上的治疗评估研究奠定了坚实的基础。

图形摘要

基于vEM的人类皮质类器官微连接组学分析工作流程：首先对皮质类器官进行样本制备、树脂包埋和半薄/超薄切片处理，然后利用大面积SEM马赛克成像技术确定感兴趣的区域以进行FIB-SEM靶向观察。超微结构观察结果通过TEM独立验证，从而建立了一套可扩展的流程，用于人类大脑类器官的连接组重建和亚细胞分析。该图像由BioRender生成。