纳米载体介导臭椿（Ailanthus excelsa Roxb.）植物化学物恢复miR-34a直接靶向NOTCH1信号通路抑制三阴性乳腺癌肿瘤干性

《Clinical Phytoscience》：Nanocarrier-enabled restoration of miR-34a by Ailanthus excelsa Roxb. phytochemicals directly target NOTCH1 signaling to suppress cancer stemness in triple-negative breast cancer

　　

背景：三阴性乳腺癌（TNBC）是一种高度侵袭性的乳腺癌亚型，预后差、易转移且靶向治疗有限。本研究构建了叶酸功能化壳聚糖纳米粒系统，靶向miR-34a/NOTCH1信号轴，并通过体外、体内及生物信息学方法评估其抗癌潜力。方法：纳米粒经离子凝胶法制备，表征了粒径、表面电荷、多分散指数（PDI）及药物释放行为；通过叶酸功能化增强肿瘤靶向效率；在MDA-MB-231细胞中采用活力、迁移、侵袭及肿瘤球（tumorsphere）实验评估生物学效应；机制研究包括双荧光素酶报告实验、救援实验、转录组测序及基于TCGA的生物信息学分析；体内评估抗肿瘤疗效、药代动力学、生物分布、毒性及生存结局。结果：纳米粒呈纳米级尺寸、低PDI、正ζ电位及缓释特征。处理显著上调miR-34a并抑制NOTCH1信号。转录组分析显示上皮-间质转化（EMT）、干性及肿瘤进展通路下调。功能上纳米粒处理降低TNBC细胞活力、迁移、侵袭及肿瘤球形成。体内抑制肿瘤生长、减少转移负荷、延长生存且系统毒性低于常规化疗。药代动力学显示长循环及肿瘤偏好蓄积。与多柔比星联用具协同效应。TCGA分析确认miR-34a与NOTCH1负相关且其预后相关性。结论：叶酸功能化壳聚糖纳米粒靶向miR-34a/NOTCH1轴是抑制TNBC进展与转移、兼顾疗效与安全性的有前景纳米治疗策略。

研究背景：三阴性乳腺癌（TNBC）占乳腺癌约15–20%，缺乏雌激素受体、孕激素受体及人表皮生长因子受体2表达，分子异质性强，常规治疗反应差，易转移且富集癌症干细胞（CSC）。NOTCH1信号异常激活维持CSC群、促进上皮-间质转化（EMT）与转移；miR-34a作为p53调控的抑癌microRNA，在TNBC中常下调，其恢复可抑制NOTCH1并削弱干性。游离miRNA治疗受核酸酶降解与递送效率低限制。臭椿（Ailanthus excelsa Roxb.）树皮含苦木素类、生物碱及黄酮等植物化学物，具抗氧化与抗增殖活性，但其对miR-34a/NOTCH1轴的调节尚未见报道。研究人员据此假设：纳米载体递送臭椿提取植物化学物可恢复miR-34a、直接抑制NOTCH1、瓦解CSC维持机制，从而延缓TNBC进展。论文发表于《Clinical Phytoscience》。

主要技术方法：研究人员采用乙醇索氏提取臭椿茎皮获得粗提物，经高效液相色谱（HPLC）与液相色谱-质谱（LC-MS）定性定量；以低分子量壳聚糖经离子凝胶法与三聚磷酸钠（TPP）成粒，EDC/NHS偶联叶酸表面功能化；以动态光散射（DLS）、透射电镜（TEM）、紫外分光法测粒径、ζ电位、包封率及透析袋法测体外释放；细胞实验使用MDA-MB-231（TNBC）与MCF-10A（正常乳腺上皮）系，通过qRT-PCR测miR-34a、双荧光素酶报告验证NOTCH1 3'UTR靶向、miR-34a抑制剂救援实验、RNA测序（RNA-Seq）做差异基因与GSEA、MTT/划痕/Transwell/肿瘤球形成评估功能；体内采用雌性无胸腺裸鼠MDA-MB-231异种移植与尾静脉转移模型，评价肿瘤体积、转移结节、生存、血药浓度（HPLC/LC-MS）及荧光标记生物分布；TCGA数据做miR-34a与NOTCH1表达相关及生存分析。

研究结果：

定量植物化学分析：HPLC与LC-MS确认臭椿乙醇提取物含苦木素类与黄酮衍生物，具备化学多样性。

壳聚糖纳米粒制备与表征：FTIR证实壳聚糖-TPP静电复合及叶酸酰胺键偶联；TEM示球形、DLS示CS-AiE-TPP约150–160 nm（PDI<0.2，ζ≈?28 mV），FA修饰后增至180–190 nm、ζ≈?32 mV；体外PBS释放呈8–12 h突释后继以48 h控释。

处理细胞miR-34a相对表达：qRT-PCR显示游离提取物即上调miR-34a，纳米粒进一步增强，FA靶向纳米粒（CS-AiE-TPP-FA）上调最强。

双荧光素酶报告实验：miR-34a模拟物显著降低NOTCH1野生型3'UTR报告活性，突变结合位点后抑制消失，证NOTCH1为miR-34a直接靶标。

miR-34a抑制逆转纳米粒效应：转染miR-34a抑制剂后，纳米粒引起的NOTCH1蛋白下调、活力下降、迁移/侵袭/肿瘤球抑制均被反转，依赖关系成立。

RNA测序：RNA-Seq示2162个差异基因（1138上/1024下），KEGG富集于PI3K-Akt、NOTCH、Wnt、TGF-β；GSEA示EMT、干性、NOTCH集向下；Nanog、SOX2、OCT4、BMI1、VIM、SNAI1、ZEB1、MMP9及NOTCH1–4、HES1、JAG1下调，CDH1上调。

MTT细胞活力：FA纳米粒72 h IC₅₀为18.2±1.1 μg/mL，优于非靶向纳米粒与游离提物；MCF-10A中IC₅₀ 97.9±4.7 μg/mL，选择性指数5.38。

伤口愈合与Transwell：FA纳米粒组24 h划痕闭合最少，Matrigel侵袭细胞数最低。

肿瘤球形成：FA纳米粒降低球数与成球效率（SFE），提示CSC自我更新受抑。

体内研究：异种移植中FA纳米粒抑瘤体积与重量、减肺肝转移结节、延长期生存，体重与血清生化毒性低于多柔比星；药代示AUC增大、t_1/2延长，荧光示肿瘤蓄积高于游离提物。

TCGA分析：TNBC中miR-34a与NOTCH1表达负关，低miR-34a/高NOTCH1组总生存（OS）与无病生存（DFS）更差。

化疗对比：FA纳米粒与多柔比星联用，体外组合指数（CI）<1，体内抑瘤优于单药且未增毒。

讨论与结论翻译：讨论指出，臭椿植物化学物经叶酸壳聚糖纳米粒递送可克服miRNA稳定性瓶颈，通过恢复miR-34a直接沉默NOTCH1，进而下调干性（CD44、CD133、ALDH1）与EMT程序，该机制由报告基因、救援实验及转录组三方印证，且TCGA临床队列支持该轴预后价值；叶酸受体介导靶向与EPR效应共同提升肿瘤偏好分布，联用多柔比星具协同且降毒潜力。结论：叶酸功能化壳聚糖纳米粒靶向miR-34a/NOTCH1轴，代表一种有望抑制TNBC进展与转移、同时改善治疗效能与安全性的纳米治疗策略。