布鲁菌效应蛋白BtpB通过促进STAT3激活调控感染期间巨噬细胞的极化

《Veterinary Research》：The Brucella effector protein BtpB facilitates STAT3 activation to regulate polarization in macrophages during infection

　　

布鲁菌（Brucella）是一种革兰氏阴性兼性细胞内病原体，可引起广泛的动物源性感染。巨噬细胞是关键的免疫与抗原呈递细胞，在不同微环境中分化为促炎性M1型或抗炎性M2型细胞。布鲁菌的BtpB蛋白是一种Ⅳ型分泌系统（T4SS）效应蛋白，通过抑制Toll样受体（TLR）信号和控制树突状细胞活化来调节宿主炎症反应。布鲁菌猪种（Brucella suis）缺失BtpB（ΔbtpB突变株）会诱导细胞内促炎因子高表达。然而，BtpB在布鲁菌感染触发的巨噬细胞极化中的作用尚不清楚。本研究以RAW264.7巨噬细胞为模型，分别用野生型B. suis S2、ΔbtpB突变株及回补株C-ΔbtpB感染细胞，结合流式细胞术、逆转录定量PCR（RT-qPCR）、蛋白质印迹（western blotting）、免疫组织化学及代谢检测进行分析。结果显示BtpB表达抑制M1极化并促进M2巨噬细胞极化。此外，BtpB上调宿主细胞信号转导与转录激活因子3（STAT3）的表达。抑制STAT3可促进感染B. suis或C-ΔbtpB细胞中一氧化氮合酶（NOS2）的表达，与ΔbtpB感染细胞无显著差异；反之，STAT3过表达导致野生型和突变型细胞中NOS2水平下调。mRNA检测与酶联免疫吸附试验（ELISA）证实了STAT3调控NOS2表达的作用。STAT3调控下的胞内增殖试验表明STAT3抑制布鲁菌复制。综上，BtpB通过调节STAT3表达抑制巨噬细胞M1极化，为深入理解布鲁菌感染机制奠定基础。

研究背景方面，布鲁菌作为革兰氏阴性兼性细胞内病原体，依赖多种毒力因子逃逸宿主天然与适应性免疫，其在巨噬细胞内长期存活是慢性感染的核心。巨噬细胞极化（M1促炎/M2抗炎）决定抗感染免疫走向，而STAT3是连接JAK/STAT、PI3K/AKT等多通路、调控极化与炎症的关键转录因子。已有研究提示布鲁菌T4SS效应蛋白BtpB可抑制TLR2/4及NLRP3炎症小体、降低肺泡巨噬细胞促炎因子，但其是否介入巨噬细胞M1/M2极化未知。鉴于ΔbtpB突变株引发更强促炎反应，研究人员假设BtpB参与极化重塑，进而在体外RAW264.7模型与体内BALB/c小鼠感染模型中系统解析BtpB–STAT3轴的功能与意义。该文发表于《Veterinary Research》。

关键技术方法上，研究人员构建并使用了B. suis S2野生型、同源重组ΔbtpB突变株及电转化回补株C-ΔbtpB；体外以RAW264.7巨噬细胞按MOI 1:100感染，设0、4、12、24 hpi时间点；体内采用6周龄雌性BALB/c小鼠腹腔注射1×10⁶ CFU各菌株，于7、14 dpi取脾。功能干预上，用STAT3特异性抑制剂Stattic（5 μM）处理及pEGFP-C1-STAT3过表达质粒转染。检测体系涵盖流式细胞术（CD86⁺/CD206⁺）、RT-qPCR、western blotting、免疫荧光（IFA）、免疫组化（IHC）、乳酸/葡萄糖代谢试剂盒及ELISA，并以CFU计数评估胞内增殖。

研究结果部分，小标题“BtpB suppresses M1 macrophage polarization in RAW264.7 macrophages”中，RT-qPCR显示ΔbtpB感染4、24 hpi后M1标记（Nos2、Il-6、Tnf-α）mRNA显著升高，M2标记（Tgfb1、Ppar-γ）早期伴性上调但24 hpi下调，Arg-1无差异；流式证实ΔbtpB组CD86⁺升、CD206⁺降，说明BtpB抑M1促M2。“BtpB promotes M2 polarization of mouse splenic macrophages”中，小鼠血清1 wpi时ΔbtpB组TNF-α、iNOS高而IL-10、TGF-β1低；脾巨噬细胞流式显示ΔbtpB组M2比例低于S2/C-ΔbtpB组，M1高于C-ΔbtpB组，体内复现结论。“BtpB suppresses intracellular NOS2 expression during Brucella infection”中，WB与IFA示ΔbtpB感染4–24 hpi的NOS2蛋白显著高表达，脾IHC示1 wpi时ΔbtpB组NOS2⁺细胞数最多，印证BtpB抑NOS2。“BtpB enhances glucose uptake while reducing lactate expression during the early phase of infection”中，代谢检测示ΔbtpB组1 hpi上清葡萄糖消耗更多、1–4 hpi乳酸更高，符合M1糖酵解增强表型。“BtpB upregulates STAT3 expression and facilitates phospho-STAT3 nuclear translocation during Brucella infection”中，WB示24 hpi时ΔbtpB组p-STAT3/STAT3比显著降低，IFA示p-STAT3核积聚减弱，表明BtpB促STAT3活化入核。“BtpB inhibits macrophage M1 polarization through STAT3 activation”中，Stattic处理抹平三株菌间NOS2差异并提升S2/C-ΔbtpB组NOS2；STAT3过表达则使ΔbtpB组NOS2降至近野生型水平，且IL-1β mRNA/蛋白降、IL-10升，证明BtpB经STAT3抑M1。“STAT3 modulates the intracellular proliferation of Brucella”中，Stattic抑制STAT3显著削弱三株菌胞内复制，过表达无额外改变，提示STAT3本身是抑菌正向因子，但BtpB缺失所致STAT3下调不足以进一步杀菌。

讨论部分总结，研究人员指出BtpB借TIR域抑TLR/NF-κB与NLRP3，本工作拓展至极化层面：ΔbtpB引发M1主导伴早期短暂M2补偿（可能经SOCS3负反馈及乳酸组蛋白乳酸化驱动），NOS2作为M1功能蛋白被BtpB压制；代谢上BtpB具NAD⁺水解酶活性，耗竭NAD⁺扰乱糖酵解，故早期ΔbtpB细胞糖摄取与乳酸升。STAT3是核心节点：BtpB升p-STAT3入核，抑STAT3解除对NOS2压制、重现ΔbtpB表型，过表达STAT3回补ΔbtpB缺陷，构成BtpB–STAT3–NOS2轴。与沙门菌SteE、结核分枝杆菌PIM2等横向比较，BtpB经T4SS递送且多靶点（TLR/DC/代谢）体现布鲁菌免疫逃逸复杂性；STAT3全抑虽抑菌却掩盖BtpB特异贡献，因T4SS其他效应蛋白（BtpA、SepA、VceC）代偿胞内存活。结论翻译：综上，布鲁菌效应蛋白BtpB通过上调STAT3表达抑制巨噬细胞M1极化并促进M2极化；同时抑制STAT3活性显著削弱布鲁菌在巨噬细胞内的增殖。这些发现阐明了BtpB在布鲁菌–宿主互作中调节炎症反应的关键机制，鉴于M1极化在抗菌防御与启动适应性免疫中的关键作用，BtpB的抑M1特性为开发减毒活疫苗提供了新思路。