基质刚度塑造肝星状细胞活化过程中的早期转录轨迹

《Hepatology International》：Matrix stiffness shapes early transcriptional trajectories during hepatic stellate cell activation

　　

**摘要**
**背景**
纤维化过程中基质刚度增加，并通过YAP依赖性机械传导驱动肝星状细胞（HSC）活化。尽管近期研究已揭示HSC存在超越经典静息态和完全活化态的异质性，但生理范围内的刚度如何影响该异质性背后的活化轨迹仍不清楚。本研究旨在确定底物刚度如何塑造转录组图谱并偏置活化轨迹。

**方法**
研究人员对培养于刚度可调聚二甲基硅氧烷（PDMS）底物（软：0.2 kPa；硬：32 kPa）上的原代小鼠HSC进行了时间分辨单细胞RNA测序（scRNA-seq），并以组织培养聚苯乙烯（TCPS）作为常规基线。体外研究结果锚定于来自小鼠和人类肝损伤的公共体内数据集。

**结果**
基质刚度改变了HSC的形态和转录状态，较软的底物促进更圆润的表型并降低活化标志物的表达，尤其在活化早期。拟时和RNA速率分析亦揭示与基质刚度相关的不同早期轨迹。在软条件下，HSC表现出扩增的静息态向起始态转变状态，其特征为Nrf2相关特征及再生相关因子（包括Hgf和Rspo3）的表达。相反，硬条件诱导了一个基因特征，该特征从HSC活化早期即上调，定位于人类肝脏纤维化间隔，并与HCV患者队列中的肝硬化严重程度相关。

**结论**
基质刚度塑造HSC早期活化轨迹，使之朝向与再生或纤维化相关的转录程序。这些发现支持将刚度受控的培养体系作为改进的HSC活化模型，并为再生和抗纤维化策略提供了框架。

**图形摘要**
（注：图形摘要为图片内容，无法以文字形式翻译，故省略。）

**基质刚度塑造肝星状细胞活化早期转录轨迹的机制与意义——论文解读**

**一、研究背景与科学问题**
肝纤维化和肝硬化是慢性肝病（CLD）的严重后果，其病因涵盖病毒性肝炎、自身免疫性肝病及日益高发的代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD），每年在全球范围内导致约两百万例死亡，主要经由肝癌发生和肝功能衰竭实现。尽管疾病负担沉重，有效的抗纤维化治疗手段仍然匮乏，迫切需要阐明疾病机制并寻找可行的干预靶点。
肝星状细胞（HSC）在肝损伤后由静息态转变为活化表型，进而转分化为分泌细胞外基质（ECM）的肌成纤维细胞，驱动纤维化进程。近期单细胞RNA测序（scRNA-seq）研究揭示了HSC存在门静脉–中央静脉分区及活化阶段依赖的转录异质性。除经典的静息态与活化态二态模型外，还鉴定出中间态HSC群体（如1期/起始态/细胞因子产生型HSC）。重要的是，HSC亦参与肝脏稳态维持和再生，例如通过产生HGF和RSPO3实现。纤维化与再生的双重角色凸显了解析其功能转换调控因素的迫切性。
在肝硬化中，组织重塑和ECM蓄积增加肝脏刚度。刚度升高与HSC活化相关，YAP/TEAD通路被认定为关键的机械转导调控因子。然而，常规体外HSC培养体系通常采用远硬于天然肝组织的底物，可能偏置早期活化程序和信号动力学。此外，YAP在体外与体内的时相动态存在差异，提示机械微环境可能以标准培养模型无法捕捉的方式塑造早期活化轨迹。然而，生理范围内的刚度如何塑造HSC早期活化轨迹，以及YAP动态在体内外为何分道扬镳，目前仍知之甚少。为此，研究人员提出假设：底物刚度塑造HSC早期活化和应激反应程序，并采用刚度受控的体外培养结合时间分辨单细胞分析及空间和临床数据集的交叉验证对该假说进行系统检验。

**二、主要技术方法**
研究人员从成年雌性BALB/c小鼠（购自CLEA Japan和Oriental YEAST）中分离原代HSC，方法为经门静脉原位灌注乙二醇四乙酸（EGTA）溶液、Pronase E溶液和IV型胶原酶溶液，随后进行Nycodenz密度梯度离心。HSC培养于刚度可调的聚二甲基硅氧烷（PDMS）底物（软：0.2 kPa；硬：32 kPa），并以组织培养聚苯乙烯（TCPS）作为常规基线。应用10x Genomics Chromium平台进行时间分辨单细胞RNA测序（scRNA-seq），涵盖第0天新鲜分离HSC、第1/3/8天TCPS培养HSC及第1/3天软/硬PDMS培养HSC。测序数据经Cell Ranger v9.0.0比对至小鼠参考基因组GRCm39，使用Seurat v5.2.0进行聚类和注释，DoubletFinder去除双细胞，AUCell算法计算基因集活性，Monocle 3和scVelo分别进行拟时和RNA速率分析，SCENIC推断转录因子调节子活性。体外结果锚定于公共体内数据集（GSE171904、GSE295293、GSE172492、GSE223558、GSE176042），并利用人类单核RNA测序数据（GSE256398）、人类肝脏空间转录组数据（E-MTAB-13132）和丙型肝炎相关早期肝硬化临床队列（GSE15654）进行验证。统计分析采用配对双尾Student's t检验、单因素方差分析及加权线性回归，竞争风险模型采用Fine–Gray回归。

**三、研究结果**

**（一）原代小鼠HSC体外培养过程中的自发活化**
研究人员分离原代小鼠HSC并培养于TCPS上。新鲜分离的HSC保留胞质脂滴，培养过程中出现时间依赖的细胞骨架重塑。对第1天（d1TCPS）、第3天（d3TCPS）、第8天（d8TCPS）培养HSC及第0天（d0）新鲜分离HSC进行时间分辨scRNA-seq。聚类后依据标志基因注释细胞类型，HSC群表达Reln、Acta2和Col1a1，其他非实质细胞类型表达各自典型标志基因。提取HSC群后发现，第0天HSC重现门静脉–中央静脉分区（门静脉周亚群表达Rspo3、Spon2、Sox4等；中央静脉周亚群表达Ngfr、Rgs4、Igfbp3等）。在TCPS上，静息相关基因（Lrat、Cygb）在第0天达峰，活化标志物（Acta2、Col1a1）随时间渐增，基因集评分显示静息HSC特征丢失而活化特征获得，与体外HSC活化进程一致。

**（二）体外活化HSC中YAP信号持续激活**
YAP/TAZ信号是HSC活化的关键驱动因素。在scRNA-seq数据中，YAP/TAZ靶基因（Ankrd1、Ccn1、Thbs1）在培养启动后迅速诱导，第1天即达高表达水平。应用已发表YAP/TAZ相关基因集进行单细胞水平基因集评分，YAP/TAZ特征评分在第1天升高并在第3天和第8天维持高位。然而，在体内纤维化数据集（CCl4、BDL、TAA模型）中，YAP/TAZ相关基因特征在纤维化HSC中仅显示有限富集；在CCl4时间序列模型中，该特征在损伤后升高但不随反复CCl4暴露持续上升，而是趋于平台期或下降；在APAP急性肝损伤模型中，该特征短暂升高并于损伤后约12小时达峰后回落。综上，YAP/TAZ活性在TCPS体外培养中持续激活，而体内YAP/TAZ相关特征富集有限且往往呈瞬时性。

**（三）底物刚度调控体外HSC活化过程中的形态变化**
TCPS具有约3 GPa级别的高刚性。为模拟生理性（0.2 kPa，软）与纤维化样（32 kPa，硬）条件，研究人员建立基于PDMS的刚度可调培养平台。形态学分析显示，第1天软底物上HSC突起延伸较少并维持圆形形态，而硬底物上HSC形态更为伸展；该形态差异在第3天和第8天逐渐减小。定量形态学分析表明，软条件下HSC在第1天表现出显著更高的圆度（circularity）、球形度（roundness）和实心度（solidity），第3天实心度升高，第8天圆度升高。在0.2、2、8、32 kPa四种刚度条件下，第1天形态分析显示刚度递增与圆度降低及形态更为伸展相关，呈现梯度变化。此外，通过FACS评估维甲酸储存，第3天硬条件下维甲酸储存显著下降。这些结果表明PDMS刚度调控原代小鼠HSC体外活化相关的形态变化。

**（四）刚度在转录水平调控体外活化早期阶段**
研究人员对软/硬条件下第1天和第3天HSC进行scRNA-seq并与TCPS数据整合。UMAP显示第1天三种刚度条件在空间中分离，揭示活化起始阶段的刚度依赖性差异。与TCPS单独培养一致，静息标志基因表达和静息特征评分较第0天下降，活化标志基因和活化特征评分随时间升高。值得注意的是，第1天软条件下活化特征评分较低，表明HSC活化早期存在刚度依赖性差异；而第3天各条件间差异变弱。1期HSC标志基因（Ccl2、Ccl7、Cxcl1、Il11）在第1天簇中优先表达，且硬条件和TCPS条件下表达水平高于软条件。应用起始态HSC特征评分发现，第1天软条件含有低特征评分的细胞，提示存在静息态向起始态转变状态；第3天软条件下起始态特征评分反而高于硬/TCPS条件，表明软条件下该特征达峰延迟。体内批量RNA-seq数据亦显示，正常肝脏中起始态特征在CCl4损伤后呈渐进性早期升高，而反复CCl4预处理的肝脏中该特征更早且更急剧地升高。综上，刚度相关的HSC转录组差异主要在活化早期出现，随时间推移逐渐减弱，第1天软条件富集低起始态特征评分的细胞，符合静息态向起始态转变状态。

**（五）软底物上早期活化HSC表现出Nrf2通路激活**
聚焦第1天亚聚类分析，13个簇中第1天细胞主要分布于簇1、5、6、7、9。簇1为硬条件优势簇，簇6为软/硬混合群，簇7为软条件特异簇。特征评分显示簇7具有较高静息评分和较低活化评分，簇1活化评分较高，簇6两个程序评分均低。拟时分析（Monocle 3）重现从第0天至第1、3、8天的时间进程，显示静息标志物（Ngfr、Rgs5）下调、趋化因子（Ccl2、Ccl7）早期诱导及经典活化标志物（Acta2、Col1a1）随后表达。拟时轨迹推断从簇6向簇7和簇1的转变，RNA速率分析支持该流向。簇6被定位为早期转变状态，软条件倾向朝簇7推进，而硬条件倾向朝簇1推进。直接比较簇7（d1soft特异）与簇1（d1hard优势）：簇7富集HALLMARK活性氧通路（REACTIVE_OXYGEN_SPECIES_PATHWAY）；SCENIC调节子分析鉴定出簇7中Nfic、Atf6b、Zfp652、Nfe2l2（Nrf2）、Pir、Nfe2l1、Cenpb等调节子活性升高，其中Nfe2l2（抗氧化反应关键调控因子）在簇7和簇6中调节子活性升高。簇7中Nfe2l2及其靶基因（Keap1、Nqo1、Prdx1）表达上调，REACTOME_KEAP1_NFE2L2_PATHWAY富集。拟时分析显示Nfe2l2及其靶标表达在早期拟时值达峰。体内数据集中，KEAP1–NFE2L2通路在单次CCl4给药后和APAP损伤早期升高，提示Nrf2激活与早期损伤相关HSC反应相关而非基础健康态。此外，簇7高表达再生相关因子Hgf和Rspo3。加权线性回归分析显示，REACTOME_KEAP1_NFE2L2_PATHWAY评分与Hgf呈临界正相关（β = 4.034，95%CI ?0.018–8.085，p = 0.051），与Rspo3呈显著正相关（β = 10.915，95%CI 3.725–18.104，p = 0.007）。因此，低基质刚度优先支持再生相关表型，而高刚度促进HSC活化并使细胞状态转向更活化特征。

**（六）高刚度相关早期活化特征与体内纤维化相关**
聚焦簇1相对簇7上调的基因，簇1富集MYC相关基因集、未折叠蛋白反应和肌生成等活化相关通路。从簇1高表达基因中筛选29个基因（log2FC > 1.5）定义为小鼠HSC Early_Hard_Signature（HSC早期硬条件特征）。特征评分证实d1hard显著高于d1soft，且在第3天和第8天维持高水平。在体内小鼠肝损伤和纤维化模型scRNA-seq数据中，该特征在慢性纤维化模型（CCl4、BDL、TAA诱导）中富集，并在反复CCl4给药后保持升高；在单次CCl4损伤和APAP损伤早期亦被诱导。从该特征中选取28个具有人类直系同源基因的基因，应用于人类单核RNA测序数据集（GSE256398），与健康对照和MASLD F0组相比，该特征评分在MASH相关纤维化组和酒精相关性肝炎组中升高，并在各病因肝硬化中维持高位。在人类纤维化肝脏空间转录组数据（E-MTAB-13132）中，定位于纤维化区域的簇表现出更高的特征水平。在丙型肝炎相关早期肝硬化临床队列（GSE15654）中，以ssGSEA评分中位数将患者分为高/低表达组，高Early_Hard_Signature评分组表现出更高的Child–Pugh进展累积发生率（Fine–Gray竞争风险回归p = 0.0028），表明该特征与人类肝纤维化疾病进展相关。

**四、讨论与结论**
**讨论总结**：本研究整合刚度受控培养与时间分辨scRNA-seq，证实早期活化相关转录动力学受基质刚度调节。软条件下Nrf2活性静息态向起始态转变状态扩增，伴随再生相关因子（Hgf、Rspo3）表达升高；硬条件则富集簇1并衍生出Early_Hard_Signature，该特征在体内纤维化间隔中升高并与临床队列疾病进展相关。研究认为刚度定义的机械微环境塑造HSC早期活化轨迹，软硬基质分别与再生相关和基质重塑相关程序相关联。关于YAP/TAZ，其通路在标准培养条件下的持续激活与聚苯乙烯高刚性引起的培养特异性机械贡献一致，而体内纤维化模型中YAP通路升高有限。研究使用刚度定义的PDMS底物模拟HSC感知的局部基质环境，0.2 kPa和32 kPa分别代表正常样软和肝硬化样硬条件，2和8 kPa中间刚度梯度形态变化支持HSC反应具有刚度依赖性。软条件下Nrf2活性HSC富集并持续较久，结合体内Nrf2激活证据，Nrf2可能参与肝损伤后HSC早期应激耐受而非静息态维持，与Hgf和Rspo3表达升高共同构成肝保护性再生相关反应。研究主要优势在于刚度受控调节联合原代HSC时间分辨单细胞分析，并在独立人类数据中验证。局限性包括：实验模型不能完全再现肝脏机械环境（TCPS与PDMS除刚度外表面化学性质亦不同，主要比较基于PDMS平台内软硬条件）；转录组和功能分析仅限于0.2和32 kPa，中间刚度仅行形态学分析；主要刻画早期活化阶段的变化而非持续至后期（后期α-SMA、前胶原I、纤连蛋白和增殖无显著差异）；多数发现基于scRNA-seq分析，未对YAP或Nrf2进行操作，不能确立直接调控作用，软条件下Nrf2相关特征和Hgf/Rspo3升高是再生相关转录特征但不证明促进体内肝再生。
**研究结论翻译**：综上，研究人员在单细胞分辨率下证明基质刚度塑造HSC早期活化轨迹：软条件与以再生相关和Nrf2相关基因表达为特征的转变状态相关，而硬条件与早期活化相关转录程序相关。此外，源于硬条件的Early_Hard_Signature定位于纤维化间隔并与Child–Pugh进展相关，提示其作为人类肝纤维化疾病进展指标的潜在用途。这些发现为在设计靶向HSC活化的再生或抗纤维化策略时考虑基质刚度提供了框架。刚度受控的HSC培养体系及伴随的转录组数据集为阐明早期HSC活化的病理生物学提供了有用模型。