未固定、未脱钙、未包埋的新鲜及埋藏学改变人类骨骼的制备与五种常用染色剂和染料染色的技术说明

《International Journal of Legal Medicine》：A technical note on the preparation and staining of unfixed, undecalcified and unembedded fresh and taphonomically altered human bone with five common stains and dyes

　　

人类学与法医学调查常依赖骨骼化人类遗骸作为生活方式、年龄及死后间隔（post-mortem interval, PMI）预测的唯一证据。近期研究表明，组织学染色（histological staining）有潜力扩展或改进可从骨微观结构中提取的信息。然而，组织学染色在（埋藏学改变的）人类骨骼上的应用与研究仍十分有限，导致可用方法学缺乏。本研究中，研究人员针对未脱钙、未包埋和未固定的人类骨骼，改良了用于光学显微镜的骨玻片制备方案，以及苏木精-伊红（Hematoxylin and Eosin, H&E）、天狼星红与快绿（Sirius Red & Fast Green, SR&FG）、甲苯胺蓝（Toluidine Blue）、马松三色（Masson's Trichrome）和偶氮卡红G（Azocarmine G）五种染色方案。最终方法被应用于新鲜骨、冷藏骨和埋藏学改变骨，以观察染色结果间的差异，以及可从染色中提取的信息。成功染色的骨切片分别基于染色剂对骨中目标微结构或对胶原分子的亲和力，揭示了骨形态学和胶原含量信息。这些骨制备与染色方法是推动其他染色剂适用于人类骨骼研究的重要一步，并最终有助于建立统一化的组织学方法，以支持法医人类学调查。

**论文解读：五种常用染色剂在未固定、未脱钙、未包埋人类骨骼制备与染色中的应用**

**一、研究背景与问题**

人类学与法医学调查常以骨骼化人类遗骸作为生活方式、年龄及死后间隔（post-mortem interval, PMI）预测的唯一证据。骨微观结构分析可提供关于骨代谢、疾病、死亡年龄及死后分解程度等关键信息。皮质骨由间质骨和骨单位（osteon）构成，骨单位为基本结构功能单元，由围绕哈弗斯管（Haversian canal）同心排列的骨板层构成，以粘合线（cement line）与相邻骨单位及间质骨分界，骨细胞（osteocyte）位于骨陷窝内并经骨小管网络相互连接。这种高度有序的结构为基于骨重建量进行年龄预测、基于创伤后骨沉积判断伤后存活时间，以及识别埋藏学改变（taphonomic alteration，如昆虫啃食、脱矿、开裂、细菌隧道等）提供了组织学基础。尽管组织化学染色在骨微观分析中的潜力已被证实，但在（埋藏学改变的）人类骨骼上的应用与研究仍十分稀少，导致可用方法学缺乏。现有方案多针对石蜡包埋样本或动物骨样本，而动物骨与人骨在密度、孔隙率及组织学模式上存在差异，染色程序可能需要调整后才能适用于人类样本。Sluis等人（2025）综述了45种可用于埋藏未脱钙骨的染色剂，但绝大多数缺乏针对未脱钙人骨的操作方案。因此，本研究的目的在于为五种常用染色剂——苏木精-伊红（Hematoxylin and Eosin, H&E）、天狼星红与快绿（Sirius Red & Fast Green, SR&FG）、甲苯胺蓝（Toluidine Blue）、马松三色（Masson's Trichrome）及偶氮卡红G（Azocarmine G）——建立适用于未固定、未脱钙、未包埋人类骨骼的制备与染色方案，并观察不同保存状态下骨骼的染色差异及可提取的信息。

**二、研究设计与关键技术方法**

样本来自阿姆斯特丹UMC医学生物学系遗体捐赠项目的四名捐赠者（两名女性，80岁与84岁；两名男性，78岁与91岁）的肱骨、胫骨和股骨，分为新鲜骨（死后3天内处理）、受控老化骨（4°C密闭容器储存1至2年）和埋藏学改变骨（埋葬2年后掘出并于室温保存）。研究采用Maat等改良的Frost手动研磨法制备骨切片，经梯度砂纸湿磨至透光、超声清洗；部分样本以1%甲酸酸蚀5分钟；分别进行五种染色方案染色后脱水、封片，以光学显微镜观察成像。

**三、研究结果**

**未染色标本**：哈弗斯管、部分骨单位及裂缝清晰可见，用作染色对比参照。

**H&E染色**：增强同心板层与间质板层可视化，选择性着色部分骨单位和粘合线；苏木精主要贡献板层着色，无酸蚀时伊红单独染色效果差。

**SR&FG染色**：新鲜骨以红色为主，受控老化和埋藏学改变骨以绿色为主，表明胶原含量降低；同时增强同心板层对比度，有助于区分骨单位与间