《Journal of Neuro-Oncology》：Annexin A2 associated with bevacizumab resistance and infiltrative escape in glioblastoma
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背景：贝伐珠单抗(Bev)在胶质母细胞瘤(GBM)中的临床获益通常是短暂的，因为肿瘤会发展出适应性耐药，其特征是从血管生成依赖性生长转向浸润性生长。本研究探讨了同时调节血管生成与侵袭的膜联蛋白A2(ANXA2)作为Bev耐药潜在生物标志物的可能性。
方法：研
背景：贝伐珠单抗(Bev)在胶质母细胞瘤(GBM)中的临床获益通常是短暂的，因为肿瘤会发展出适应性耐药，其特征是从血管生成依赖性生长转向浸润性生长。本研究探讨了同时调节血管生成与侵袭的膜联蛋白A2(ANXA2)作为Bev耐药潜在生物标志物的可能性。
方法：研究人员采用实时定量PCR和免疫组织化学/免疫荧光技术分析了来自33例GBM患者的66份组织标本。该队列包括15例Bev-na?ve（未接受过Bev）病例和18例新辅助Bev（neoBev）治疗病例。评估了33份难治性标本（包括来自同一患者不同治疗阶段（初次切除对难治期）的独特配对样本），以将ANXA2表达水平与无进展生存期(PFS)、总生存期(OS)和MRI复发模式相关联。
结果：多变量分析确定ANXA2高表达是PFS和OS的显著独立不良预后因素。在neoBev组中，ANXA2 mRNA低表达患者的总生存结局显著优于高表达患者。尽管ANXA2 mRNA水平在难治期趋于升高，但观察到Bev周期数与ANXA2表达水平之间存在显著负相关。组织病理学分析显示，在GBM前缘的肿瘤血管和间质中ANXA2表达强烈，并与缺氧标志物缺氧诱导因子-1α共定位。
结论：ANXA2可能作为Bev治疗中从血管生成表型向浸润表型适应性转变的预测性生物标志物。这些发现表明ANXA2可作为Bev临床获益的预测性生物标志物，并可能是需要在GBM中进一步验证的候选治疗靶点。
论文解读：膜联蛋白A2在胶质母细胞瘤贝伐珠单抗耐药与浸润性逃逸中的作用
胶质母细胞瘤(GBM)是恶性程度最高的脑肿瘤，具有进展迅速和预后极差的特点。贝伐珠单抗(Bev)是一种靶向促血管生成蛋白血管内皮生长因子(VEGF)的单克隆抗体，已被批准用于GBM治疗，尤其在复发阶段。然而，III期临床试验显示Bev并不能显著改善初发GBM的总生存期(OS)，即便能引起肿瘤体积大幅缩小，其疗效也往往是短暂的。在日本，Bev被批准用于新诊断GBM的初始治疗，这一策略在全球范围内较为特殊。研究人员此前曾利用Bev初治、治疗中和难治性患者的配对标本，对VEGF及其他血管生成相关因子、肿瘤氧合状态、干性和免疫调节机制进行了比较分析，以探索耐药机制。既往研究提示，Bev虽然可有效抑制血管生成，却可能通过代偿性机制促进肿瘤侵袭，从而限制长期疗效。基质金属蛋白酶(MMPs)尤其是MMP2和MMP9已被发现与Bev治疗后更差的生存结局相关，提示抗血管生成治疗与侵袭性逃逸之间存在机制联系。因此，识别同时参与血管生成和侵袭的分子对于理解Bev的适应性耐药至关重要。膜联蛋白A2(ANXA2)在GBM中常过表达，与侵袭性增强、上皮-间充质转化(EMT)及不良临床结局相关。功能上，ANXA2通过激活纤溶酶原及下游MMP2和MMP9促进细胞外基质降解，从而促进GBM侵袭。由于ANXA2在血管生成和侵袭通路中均处于上游调控位置，研究人员假设其可能是比MMP2、MMP9、金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP-1)和纤溶酶原激活物抑制剂(PAI-1)等更可靠的预测性生物标志物，并可能参与GBM对Bev的适应性耐药。为此，本研究利用日本特有的新辅助Bev治疗(neoBev)可获取手术标本的条件，系统分析了Bev治疗过程中ANXA2表达动态与患者生存及影像复发模式的关系。论文发表于《Journal of Neuro-Oncology》。
研究人员采用的主要技术方法包括：从66份来自33例GBM患者的福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织样本中提取RNA，通过实时定量PCR(qRT-PCR)检测ANXA2 mRNA表达，并以GAPDH和β-肌动蛋白(ACTβ)作为内参；采用免疫组织化学(IHC)和免疫荧光(IF)评估ANXA2蛋白的空间分布及其与缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)、CD133的共定位；依据改良的神经肿瘤学反应评估(mRANO)2.0标准评价影像学反应；利用多变量Cox回归、Kaplan-Meier分析、Spearman秩相关及Wilcoxon符号秩检验等统计方法。样本队列包括三组：15例Bev初治（na?ve Bev）新诊断GBM、18例术前接受neoBev后切除的GBM，以及33例Bev失败后的难治性GBM（其中22例来自尸检、11例来自挽救手术），并包含同一患者在不同治疗阶段的配对标本。
在患者特征分析中，多变量Cox回归显示neoBev与较长的无进展生存期(PFS)独立相关（风险比(HR)：0.33，p=0.010），但与OS无关；男性性别(p=0.025)和较长替莫唑胺(TMZ)暴露(p=0.031)是OS的独立影响因素。值得注意的是，ANXA2 mRNA高表达是较短PFS(HR：2.85，p=0.028)和较短OS(HR：3.12，p=0.015)的稳健独立不良预后因素。
配对样本比较分析显示，在na?ve-refractory和neoBev-refractory配对标本中，ANXA2 mRNA表达水平在难治期均呈上升趋势，但差异未达到统计学显著性（p=0.244和p=0.205）。
剂量依赖性ANXA2 mRNA表达变化分析中，将全部样本作为单一队列进行线性回归，发现ANXA2 mRNA表达水平随Bev治疗周期数增加而显著下降（r=?0.456，p=0.009）。按Bev给药周期数将患者分为1–10、11–20、≥21周期三组后，11–20周期组较≤10周期组ANXA2表达显著降低（p=0.017），而≥21周期组维持较低表达水平。此外，在公开的TCGA GBM RNA-seq数据中，ANXA2表达与MMP9（ρ=0.23，p<0.01）和HIF1A（即HIF-1α）（ρ=0.21，p=0.01）呈显著正相关，但与MMP2无显著相关。
IHC与IF分析显示，ANXA2在肿瘤性胶质细胞和间质中呈细胞质表达，在GBM前缘的肿瘤血管中表达尤为突出。三标IF实验显示，ANXA2、HIF-1α和CD133在肿瘤核心和前沿区域存在共定位，但HIF-1α蛋白表达在前沿区域几乎缺失。IHC和IF均未显示na?ve Bev与neoBev组之间在HIF-1α、ANXA2和CD133蛋白染色模式上有显著差异。
MRI复发模式及mRANO 2.0分析中，在cT1-flare up、T2弥漫和T2局限三种MRI复发模式之间，na?ve Bev组和neoBev组的ANXA2表达均无显著差异。根据mRANO 2.0标准，neoBev组中4例部分缓解、13例疾病稳定、1例疾病进展，三组间PFS和OS均无统计学显著差异。
生存结局与ANXA2表达模式分析发现，将ANXA2 mRNA表达按中位数分为高低两组后，低表达组的OS显著更长（例如na?ve Bev组18.0个月对21.8个月，neoBev组10.9个月对19.9个月，p=0.003）。在neoBev组内部，低ANXA2表达患者的PFS显著长于高表达患者（p=0.034），OS亦显著更长（p=0.004）。而neoBev高ANXA2表达组的OS显著差于na?ve Bev高表达组（p=0.029）。以neoBev低表达组为基准的两两比较显示，neoBev高表达组的死亡风险升高（OS HR：2.701，95%置信区间：0.953–7.660，p=0.061），但该差异未达到统计学显著性。
讨论部分指出，ANXA2可调节纤溶酶生成并激活下游MMP2和MMP9，从而促进血管生成和细胞外基质降解。Bev治疗可能使GBM从血管生成依赖性生长转向侵袭驱动表型，而ANXA2-纤溶酶-MMP轴可能参与这一适应性转变。ANXA2还受HIF-1α通过缺氧反应元件直接调控，并可稳定HIF-1α形成正反馈环。ANXA2还可激活信号转导与转录激活因子3(STAT3)信号，促进EMT和抗血管生成治疗耐药。本研究发现虽然整体上Bev治疗降低ANXA2表达，但neoBev组中仍存在高ANXA2表达亚群且预后更差，提示绝对ANXA2水平可能较群体趋势更能反映生物学耐药。低ANXA2表达可能是neoBev获得最佳临床获益所需的条件。研究人员认为，基于活检的ANXA2表达水平指导neoBev治疗可能是一种有前景的策略；同时，常规影像学评估可能无法完全捕捉ANXA2驱动的侵袭性逃逸。该研究存在样本量小、回顾性设计、WHO CNS5分子分型数据不完整及缺乏功能验证等局限性。
结论部分翻译如下：Bev治疗期间ANXA2表达水平的动态变化可显著影响患者结局。ANXA2反映了Bev诱导的变化，与血管生成和肿瘤侵袭均相关。这些结果将ANXA2确立为一种多功能分子指标，既可作为预后因素，也可作为neoBev治疗的预测性生物标志物。
