《Molecular Biomedicine》：A dimeric mRNA vaccine based on key-mutant and KP.3 RBDs induces broad-spectrum immunity and protects mice against JN.1 and XDV challenges
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严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（SARS-CoV-2）Omicron亚变异株的持续抗原进化已逐步侵蚀疫苗诱导的保护性免疫，迫切需要能够针对系统发育分化菌株提供广谱保护的下一代候选疫苗。本研究报道了SV的设计与临床前评价——一种编码异源二聚体受体结合域（RBD）
严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（SARS-CoV-2）Omicron亚变异株的持续抗原进化已逐步侵蚀疫苗诱导的保护性免疫，迫切需要能够针对系统发育分化菌株提供广谱保护的下一代候选疫苗。本研究报道了SV的设计与临床前评价——一种编码异源二聚体受体结合域（RBD）抗原的mRNA疫苗。在该构建体中，先前优化的单体RBD（BSCOV06）与KP.3 RBD以串联方式连接，在单一免疫原中呈现两个抗原性不同的RBD。在BALB/c小鼠中，两剂SV免疫方案诱导了高滴度中和抗体，对BA.1、XBB.1.5、JN.1、KP.3以及系统发育上远缘的XDV变异株均表现出强效交叉反应。整合的B细胞受体（BCR）和T细胞受体（TCR）免疫组库分析表明，相对于BSCOV06，SV驱动了质上不同的适应性免疫重塑。关键特征包括：升高的类别转换体细胞超突变（SHM）、持续的初始B细胞募集、广泛的克隆性T细胞扩增，以及两个淋巴细胞区室中广泛的VJ基因使用重编程。在BALB/c和K18-hACE2转基因小鼠中，SV对JN.1和XDV攻击提供了强效保护，显著降低肺部病毒载量并减轻组织病理学损伤。值得注意的是，SV达到的免疫原性和交叉保护效力与三剂BSCOV06方案相当或超过后者，支持了异源二聚体抗原设计的潜力。这些发现表明SV是一种有前景的广谱COVID-19候选疫苗。更广泛地说，研究提示，整合抗原性分化变异株的异源二聚体RBD结构可能代表一种可推广的平台，用于应对病毒免疫逃逸，对未来SARS-CoV-2变异株和其他快速进化的病毒病原体具有重要意义。
论文解读
研究背景
由严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（SARS-CoV-2）引起的2019冠状病毒病（COVID-19）大流行已造成全球超过7.7亿确诊病例和710万死亡病例（截至2025年11月）。疫苗接种仍是疫情防控的基石，但Omicron谱系及其后代——尤其是JN.1亚变异株及其衍生的KP.2、KP.3和XDV——在受体结合域（RBD）内累积了密集的免疫逃逸突变。其中，KP.3尤为突出：F456L和Q493E突变之间的独特上位相互作用同时增强了ACE2结合亲和力并赋予对I类中和抗体的深刻抗性，使KP.3在适应性和免疫逃逸方面优于JN.1和KP.2。世界卫生组织已建议将疫苗抗原组分更新为JN.1谱系序列，亟需纳入KP.3来源RBD抗原的下一代疫苗。
RBD是刺突蛋白（Spike）上中和抗体的主要靶标，也是成熟的疫苗设计免疫原。基于RBD的抗原可将体液应答聚焦于关键中和表位，同时最小化对Spike蛋白上其他非中和表位的暴露。异源二聚体RBD结构——以串联方式呈现两个抗原性不同的RBD——比同源二聚体或单体对应物引发更广泛、更强效的中和应答，可能通过在亲和力成熟过程中扩大募集的B细胞克隆库来实现。mRNA-脂质纳米颗粒（mRNA-LNP）平台适合同时激活适应免疫的体液和细胞免疫臂，提供快速迭代的抗原再设计、内在佐剂活性和成熟的临床安全性。
研究人员此前构建了BSCOV06——一种基于单体RBD的mRNA疫苗，整合了H346T、L368I、V445P和F490S突变，对XBB和EG.5亚谱系具有强效免疫原性。然而，其单体设计和pre-JN.1 RBD骨架限制了对KP.3来源变异株的中和广度。此外，疫苗诱导的BCR和TCR克隆结构如何贡献于RBD疫苗的广度仍知之甚少。研究人员假设，由BSCOV06 RBD和KP.3变异株RBD串联共价连接的异源二聚体RBD抗原，将引发优于单体原型的体液和细胞免疫，同时驱动质上不同的B和T细胞组库重塑。
关键技术与方法
本研究采用了以下主要关键技术方法：样本队列来源于无特定病原体（SPF）雌性BALB/c小鼠（6–8周龄）和转基因雌性K18-hACE2小鼠（6–8周龄）。关键技术包括：mRNA体外转录（IVT）与脂质纳米颗粒（LNP）包封及理化表征；活病毒中和实验与假病毒中和实验；酶联免疫吸附测定（ELISA）检测RBD特异性结合抗体；酶联免疫斑点（ELISpot）实验检测抗原特异性细胞因子分泌；流式细胞术分析脾脏生发中心（GC）B细胞与记忆T细胞；配对BCR和TCR免疫组库高通量测序；免疫荧光检测抗原表达与病毒清除；以及肺部病毒载量定量和组织病理学评分。统计方法采用单因素方差分析（ANOVA）和Dunnett检验。
研究结果
SV疫苗的表征、表达与生物分布
研究人员将KP.3变异株RBD融合至BSCOV06支架上，构建为单链融合蛋白——异源二聚体抗原SV。Cryo-EM二维分类显示二聚体样形态，蛋白质结构经AlphaFold3计算预测。DLS测得平均粒径为102.3 ± 3.5 nm，PDI为0.08，表明颗粒均一；ζ电位为?28.4 ± 1.2 mV，包封效率超过95%；Cryo-EM确认球形、单分散形态。Western blot验证了HEK 293T细胞中SV抗原的表达。生物分布分析显示，肌注后6、24、72小时在淋巴结、肌肉、肝脏和脾脏等多个组织中可检测到RNA和蛋白质，证实了稳定mRNA-LNP疫苗系统的成功构建。
SV疫苗引发自限性天然免疫激活和广谱中和抗体应答
BALB/c小鼠肌注不同剂量mRNA-LNP后，血清细胞因子（IL-6、TNF-α、MCP-1、RANTES、G-CSF、Eotaxin）在5小时升高，随后在24和72小时进行性下降，表明空LNP和mRNA-LNP均快速激活天然免疫而不诱导持续炎症，呈自限性应答。抗原特异性IgG对JN.1、KP.3和BA.2的应答在第21天达峰，呈剂量依赖性。中和抗体滴度（真病毒或假病毒中和实验，加强后第14天测定）与结合IgG数据一致。SV除对设计抗原（KP.3及其祖先谱系）外，还对NB.1.8.1、BA.3.2和XDV诱导可观中和抗体。该广谱中和活性持续至初次免疫后240天，与体液免疫记忆的建立一致。
SV免疫引发强效GC反应、建立细胞免疫记忆并驱动Th1偏斜免疫
加强后第14天脾脏流式分析显示，SV显著扩增生发中心（GC）B细胞，促进CD8? T细胞增殖。SV主要扩增CD8?中央记忆T细胞（Tcm），同时扩增CD4?和CD8?效应记忆T细胞（Tem），建立了外周免疫监视能力。ELISpot实验显示，用JN.1 RBD、KP.3 RBD和XDV蛋白刺激脾细胞后，IFN-γ、IL-2和IL-4均显著升高，其中IFN-γ和IL-2斑点数超过IL-4，表明SV激活Th1和Th2应答的同时建立了有利于抗病毒防御的Th1偏斜抗原特异性细胞免疫应答。
SV在BALB/c和K18-hACE2小鼠中提供对JN.1和XDV的交叉保护
在BALB/c和K18-hACE2模型中，XDV攻击后SV组体重稳定、存活率100%（PBS对照组存活率仅70%）。肺部和其他组织的病毒复制水平（gRNA和sgRNA）显著降低，10 μg剂量组在两个模型中均实现sgRNA清除。免疫荧光染色显示SV组肺部病毒N蛋白信号显著减弱。组织病理学分析显示，SV组肺损伤（包括炎性浸润、肺泡破坏、出血和血管血栓）显著减轻。JN.1攻击保护评价显示相同趋势。总体而言，两剂SV免疫可在免疫 competent 和人源化小鼠模型中提供对JN.1和XDV的交叉保护。
SV相对于BSCOV06引发质上不同的B和T细胞组库
在BCR区室中，SV组类别转换IGH同种型（IgA、IgG）和IGK链的体细胞超突变（SHM）率均高于BSCOV06和PBS对照组；同时SV组保留了最高比例的未转换IgM（60.4%），表明SV在促进类别转换区室亲和力成熟的同时维持持续初始B细胞募集。IGL区室中SV的Shannon多样性和独特克隆数均超过BSCOV06。在TCR区室中，SV诱导显著高于BSCOV06的TCRβ克隆性（0.142 vs 0.099），反映了广泛克隆性扩增而非寡克隆优势；SV与BSCOV06仅共享124个TCRβ克隆型，而BSCOV06与PBS共享229个，表明SV引发的T细胞组库与原型疫苗显著不同。差异VJ配对分析进一步确认了这种分化。
SV在BALB/c小鼠中表现出良好的初步安全性
低剂量（1 μg）和高剂量（10 μg）SV免疫后7天内，体重和体温均未受明显影响。反映肝细胞完整性的ALT、AST，肝胆排泄功能的TBIL、DBIL，肝脏合成功能的ALB和肾功能的CREA等血清生化指标在24小时和第7天均无显著异常。肌肉、肝脏等多组织器官的组织病理学分析未见疫苗诱导的病理改变，表明SV疫苗具有良好的初步安全性。
讨论与结论
讨论部分首先指出，Omicron谱系的持续抗原漂移已侵蚀株匹配单体疫苗的保护效力，而异源二聚体RBD疫苗在JN.1/KP.3谱系背景下的优势尚未被系统研究。本研究的核心发现是：两剂SV免疫在BALB/c和K18-hACE2小鼠模型中达到了与三剂BSCOV06相当或超过的结合和中和抗体滴度、抗原特异性T细胞应答及体内交叉保护——这种"剂量节省"效应可能具有实际意义。
在分子层面，SV不同于早期异源二聚体RBD疫苗的关键之处在于：它并非配对两个时间相邻的RBD，而是将BSCOV06 RBD骨架与携带赋予JN.1谱系增强适应性的F456L/Q493E上位对的KP.3 RBD偶联。这种刻意抗原更新与异源二聚体格式的结合可能贡献了观察到的交叉中和广度。
研究也坦承局限性：保护效力和初步安全性仅在BALB/c或K18-hACE2小鼠模型中评估，需非人灵长类评估以支持临床转化；仅证明了对JN.1和XDV的保护，研究期后出现的变异株效力未测试；当前mRNA-LNP主要诱导系统性免疫，黏膜免疫可能需要优化递送策略；结构和表位证据为计算性质，有待实验高分辨率结构确认；尚未建立最佳加强方案；未与当前使用或更新的mRNA疫苗（如XBB.1.5基础疫苗）进行比较。
结论： 综上所述，本研究表明，整合KP.3变异株RBD的异源二聚体RBD mRNA疫苗可实现与三剂单体原型BSCOV06相当或超过的两剂免疫原性和保护，并表现出良好的初步安全性。抗体、细胞和免疫组库数据共同表明，异源二聚体设计引发了超出血清学终点所捕获的质上不同的免疫应答。这些发现支持SV作为一种有前景的广谱COVID-19候选疫苗，并例证了一种可能适用于抗原可变病原体的设计策略。该论文发表于《Molecular Biomedicine》。
