从人iPSC来源的肾类器官生成功能增强的近端肾小管细胞

《EXPERIMENTAL AND MOLECULAR MEDICINE》：Generation of the functionally enhanced proximal tubular cells from human iPSC-derived kidney organoids

　　

人肾近端肾小管上皮细胞（human renal proximal tubular epithelial cells, RPPTCs）对于探索肾损伤病理生理的分子和细胞机制至关重要。在本研究中，研究人员从人诱导多能干细胞（human induced pluripotent stem cells, iPSCs）生成了功能增强的肾类器官来源的近端肾小管细胞（functionally enhanced kidney organoid-derived proximal tubule cells, FEKOPTCs）。硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（heparan sulfate proteoglycans, HSPGs）和转化生长因子-β受体抑制剂增强了从肾类器官中分离的近端肾小管细胞（proximal tubular cells, PTCs）的功能，而这些肾类器官的血管化和成熟通过硫酸乙酰肝素蛋白聚糖和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）得到改善。与原代人肾近端肾小管上皮细胞（primary human renal proximal tubular epithelial cells, RPTECs）相比，FEKOPTCs显示出显著增强的上皮屏障功能、极化状态和转运体功能，从而改善了药物摄取功能。FEKOPTCs的转录组学特征显示其与天然人成人肾的PTCs高度相似。在肾毒性检测中，FEKOPTCs-on-chip比RPTECs-on-chip是更敏感的预测工具。通过使用CRISPR?Cas9对α-半乳糖苷酶A（alpha-galactosidase A, GLA）进行基因突变，GLA突变型FEKOPTCs重现了法布里病（Fabry disease）的功能表型。当将FEKOPTCs移植到NOD-SCID小鼠的肾实质中时，它们重新组装并再生出具有完整管腔和功能性转运体的近端肾小管结构。总之，研究结果表明FEKOPTCs是功能增强的PTCs，可应用于肾毒性检测、疾病建模和再生医学。

论文解读：功能增强的肾类器官来源近端肾小管细胞的构建与应用

肾近端肾小管细胞（proximal tubular cells, PTCs）在维持机体稳态中具有关键作用，负责重吸收大部分钠、水、氨基酸、葡萄糖和白蛋白等必需物质，并参与酸碱平衡和电解质稳态的调节。同时，肾小管转运系统使PTCs易受药物及毒性代谢物损伤，成为急性肾损伤（acute kidney injury, AKI）尤其是药物性AKI的主要靶点。目前体外研究常用原代人肾近端肾小管上皮细胞（primary human renal proximal tubular epithelial cells, RPTECs）和人肾2（human kidney 2, HK-2）细胞系作为PTC模型，但二者均存在明显局限：RPTECs在体外培养中易去分化、衰老并丢失关键转运体；HK-2细胞则因转运体表达少、易发生上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）而难以准确模拟体内PTC功能。人诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells, iPSCs）来源的肾类器官含有肾单位组分，是PTCs的潜在来源，但类器官成熟度不足限制了其应用。此前研究显示肾脱细胞细胞外基质（decellularized extracellular matrix, dECM）可促进类器官血管化和成熟，但天然人肾来源受限且批次差异大。为此，研究人员选择肾dECM中的关键活性成分——硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（heparan sulfate proteoglycans, HSPGs）和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF），通过优化组合建立了血管化、成熟肾类器官的分化方案，并进一步分离和培养PTCs，最终获得功能增强的肾类器官来源近端肾小管细胞（functionally enhanced kidney organoid-derived proximal tubule cells, FEKOPTCs）。该研究发表于《实验与分子医学》（EXPERIMENTAL AND MOLECULAR MEDICINE），展示了FEKOPTCs在肾毒性测试、遗传性肾病建模和再生医学中的应用潜力。

研究人员使用的外周血单个核细胞来自一名健康女性志愿者（已签署书面知情同意），通过仙台病毒重编程建立人iPSCs。主要关键技术包括：基于HSPG和VEGF处理的三维肾类器官分化体系；磁激活细胞分选（magnetic-activated cell sorting, MACS）分离LTL阳性PTCs；以HSPG包被结合转化生长因子-β（transforming growth factor-β, TGF-β）受体抑制剂SB431542长期培养传代建立FEKOPTCs；采用跨上皮电阻（transepithelial electrical resistance, TEER）和inulin-FITC渗漏评估上皮屏障功能，用5(6)-羧基-2',7'-二氯荧光素二乙酸酯（CDFDA）评估多药耐药蛋白2/4（MRP2/4）介导的外排功能；利用微流控芯片构建FEKOPTCs-on-chip并进行肾毒性检测；通过RNA测序（RNA-seq）与公共单细胞参考数据集比较转录组相似性；使用CRISPR-Cas9技术对GLA基因进行编辑，建立GLA突变iPSCs并分化获得法布里病（Fabry disease）模型；最后将GFP标记的FEKOPTCs移植到NOD-SCID小鼠肾实质内，评估其体内再生能力。

结果部分：

增强人iPSC来源肾类器官的成熟和血管化：通过免疫荧光和实时定量PCR验证，HSPG可促进VEGF的细胞内摄取，二者联合处理能协同增强肾类器官中PECAM1⁺内皮细胞网络的形成，增大血管直径，并上调PTCs标志物基因（GGT1、ABCB1）和足细胞标志物基因（NPHS1、NPHS2、PODXL、SYNPO）的表达。肾类器官移植到NOD-SCID小鼠肾包膜下后，联合处理组的血管化和基因表达也优于对照组。

从肾类器官中分离PTCs：利用MACS从不同分化方案来源的肾类器官中分离LTL阳性细胞。与对照组相比，HSPG和VEGF联合处理组来源的LTL阳性细胞具有更高的PTC转运体基因表达，TEER值最高，inulin-FITC渗漏最低，且表达LTL、SGLT2和ZO-1，与体内肾组织相似，被命名为成熟肾类器官来源PTCs（matured kidney organoid-derived PTCs, mKOPTCs）。

产生FEKOPTCs：mKOPTCs在HSPG包被的培养皿上培养，并加入TGF-β受体抑制剂SB431542，经连续传代至第5代后建立FEKOPTCs。该细胞呈现鹅卵石形态和多细胞穹顶结构，表达PTC标记N-cadherin。在3D培养条件下可形成由单层细胞围成、具有极性的管腔结构。通过Transwell系统进行的10 kDa葡聚糖摄取实验显示，FEKOPTCs具有SGLT2介导的葡萄糖重吸收功能，empagliflozin抑制后摄取减少。

与RPTECs相比，FEKOPTCs具有改善的转运体表达、MRP2/4介导的排泄和上皮屏障功能：免疫荧光显示FEKOPTCs的LTL、ZO-1和laminin表达更强；qRT-PCR显示SLC34A1、ABCB1、ATP1A1、SGLT2、LRP2、PKD1、PKD2等基因表达上调；扫描电镜和透射电镜显示FEKOPTCs具有更多更长的微绒毛；RNA-seq热图显示其成熟度和分化标志物高于RPTECs和HK-2，EMT和损伤标志物更低；CDFDA外排实验表明MRP2/4介导的排泄能力更强，MK571抑制后减少；FEKOPTCs的TEER更高，inulin-FITC渗漏更低。

FEKOPTCs与天然成人肾PTCs的相似性：将FEKOPTCs的bulk RNA-seq数据与肾细胞图谱（Kidney Cell Atlas）中PT相关簇的伪bulk转录组比较，发现FEKOPTCs与体内PT簇的转录相似性高于RPTECs和HK-2。进一步筛选出300个FEKOPTCs与PT伪bulk共表达但在RPTECs和HK-2中低表达的基因，基因本体论（Gene Ontology, GO）富集分析显示这些基因与肾脏发育等生物学过程显著相关。将FEKOPTCs数据投影到人肾单细胞UMAP图上，其位置位于PT簇中心区域。BisqueRNA去卷积分析显示，FEKOPTCs的细胞组成主要为近端曲小管细胞（约44%）、近端直小管细胞（约30%）和近端小管细胞（约13%）。

使用FEKOPTCs-on-chip进行肾毒性测试：将FEKOPTCs和RPTECs分别接种于微流控芯片，动态培养10天后，FEKOPTCs-on-chip的乙酰化微管蛋白（AcT）阳性纤毛数量和长度均高于RPTECs-on-chip，流体条件下更为显著。顺铂处理后，在流体条件下，FEKOPTCs-on-chip在10 μM浓度即出现LDH释放增加，而RPTECs-on-chip在50 μM才出现；FEKOPTCs-on-chip的NGAL和KIM-1表达也在更低浓度下开始出现。此外，FEKOPTCs对顺铂的半数抑制浓度（IC₅₀）为38.85 μM，低于RPTECs的71.49 μM，表明FEKOPTCs-on-chip对肾毒性药物更敏感。

通过CRISPR-Cas9 GLA基因突变建立FEKOPTCs的法布里病模型：利用CRISPR-Cas9在人iPSCs中敲除GLA基因，经分化、分离和培养获得GLA突变FEKOPTCs。该细胞呈不规则形态，GLA蛋白和mRNA表达显著降低，PTC功能基因表达下调，油红O染色显示胞质内脂滴大量积聚，ZO-1表达减少，Gb3明显蓄积，重现了法布里肾病的核心病理特征。

GLA突变FEKOPTCs重现ERT对法布里肾病的疗效：用重组酶替代疗法（enzyme replacement therapy, ERT）处理GLA突变FEKOPTCs后，细胞形态恢复为较规则的上皮样结构，Gb3蓄积减少，MitoTracker荧光强度恢复，MitoSOX红色荧光降低，细胞内钙水平下降，TEER呈剂量依赖性恢复，表明该模型能够模拟ERT的治疗效果。

移植到NOD-SCID小鼠肾中的FEKOPTCs重新组装形成近端小管样结构：将GFP标记的FEKOPTCs直接注射至NOD-SCID小鼠肾实质，2周后HE染色显示移植处出现大量管状结构。这些GFP阳性细胞表达LTL、AQP1、SGLT2和乙酰化微管蛋白，且呈现朝向管腔的极性排列；同时宿主小鼠内皮细胞标志物MECA-32阳性血管大量浸润，说明移植物与宿主循环建立了联系。

讨论部分指出，PTCs在药物性AKI中处于核心地位，而现有RPTECs和HK-2细胞因去分化、衰老和低转运体表达等缺陷限制了其预测价值。FEKOPTCs具有成熟PTC的表型、高表达药物转运体、良好的上皮屏障功能，并可冻存和连续传代，适合用于药物肾毒性筛选、疾病模型尤其是遗传性肾病模型构建以及再生医学研究。研究结论为：FEKOPTCs是功能成熟的PTCs，可应用于肾毒性测试、疾病建模和再生医学。