基于机械性单细胞分离的胰腺内分泌细胞蛋白质组学分析鉴定膜相关通路

《EXPERIMENTAL AND MOLECULAR MEDICINE》：Proteomic analysis of pancreatic endocrine cells by mechanistic single-cell isolation identifies membrane pathways

　　

摘要
为了更深入地理解糖尿病和正常血糖状态，胰岛生物学需要在转录组和蛋白质组水平上对胰岛细胞类型进行精确的分子解析。尽管转录组分析已十分成熟，但全面的蛋白质组学表征仍然缺乏，限制了我们对胰岛分子复杂性的认识。研究人员在此引入一种非酶解、机械性的单细胞分离技术，利用激光显微切割（LMD7），能够对新鲜冷冻、未固定胰腺组织中的α细胞、β细胞和δ细胞进行物理分离，并开展蛋白质组学和转录组学分析。这种机械性方法避免了酶消化和化学固定，在样本处理前保留了细胞的天然分子状态。鉴于现有蛋白质组学数据有限，研究人员用相同方法产生的转录组学数据对研究结果进行了补充，并将其与其他人通过荧光激活细胞分选（FACS）获得的酶解分离细胞数据进行了比较。分析揭示，酶消化会改变基因表达模式，尤其是膜相关蛋白的基因表达，凸显了分离技术对生物学结果的影响。研究人员识别出在胰腺单细胞转录组数据集中通常代表性不足的细胞类型特异性蛋白。β细胞富集囊泡运输蛋白，α细胞展现出独特的钙依赖性动作电位机制，而δ细胞则表现出黏着斑相关蛋白的高表达。此外，研究人员还报道了β细胞与δ细胞之间存在的分子反向关系，这可能是由Mlxipl等转录调节因子驱动。通过在完整胰腺组织中直接建立稳健的分子谱，这项工作为未来的病理学比较提供了参考点，为研究糖尿病及其他内分泌疾病如何重塑胰岛细胞生物学提供了框架。

**论文解读：基于机械性单细胞分离的胰腺内分泌细胞蛋白质组学分析鉴定膜相关通路**

**一、研究背景与科学问题**

糖尿病是一组以胰岛素信号不足为特征的疾病，其病因包括1型糖尿病（T1D）中自身免疫攻击导致胰岛素产生不足，以及2型糖尿病（T2D）中胰岛素抵抗最终导致β细胞耗竭。胰腺胰岛作为内分泌功能的核心结构，由α、β、δ、ε及胰腺多肽（pp）细胞等多种细胞类型组成，它们通过复杂的旁分泌和结构互动共同调节机体血糖水平。传统上，胰岛细胞类型的分子表征主要依赖于转录组分析，尤其是单细胞RNA测序（scRNA-seq）和荧光激活细胞分选（FACS）。然而，这些方法大多依赖酶解（如胰蛋白酶）将组织分散为单细胞悬液，这一过程不可避免地导致膜蛋白被消化剥离，并可能激活蛋白酶激活受体2（Par2），从而改变细胞的基因表达状态。更为关键的是，胰岛蛋白质组学的发展明显滞后于转录组学，针对单个胰岛细胞类型的蛋白质组分析极少，这限制了对胰岛分子复杂性和病理状态下细胞重塑的深入理解。特别是δ细胞，由于未与特定病理直接关联，长期被忽视，其在胰岛结构和β细胞衰竭中的潜在调节作用尚不清楚，且缺少其特异性生化通路的知识。因此，亟需一种能够避免酶解和化学固定、在组织原位状态下实现单细胞类型分离并兼顾转录组与蛋白质组分析的技术，以建立健康胰岛内分泌细胞的参考分子谱，并为糖尿病等病理状态下的比较研究提供框架。

**二、研究目标与技术方法概述**

本研究的主要目标是建立并验证一种在受控生理条件下进行的机械性、非酶解的单细胞分离和多组学分析框架，为胰腺内分泌细胞类型定义参考分子谱，并利用该框架发掘可能被传统酶解流程掩盖的生物学特征。为此，研究人员开发了一套结合快速免疫荧光染色与激光显微切割（LMD7）的技术流程（图1d）。该流程将新鲜分离的胰腺组织在8分钟内进行蔗糖包埋并快速冷冻，冷冻切片制备在30分钟内完成，随后进行15分钟的快速免疫染色，最后利用LMD7在1小时内完成对α、β和δ细胞的特异性分离（图2e）。分离的细胞分别用于基于质谱（MS）的蛋白质组学分析和RNA测序。样本来源于3个月大的CFW小鼠（无特定病原体级），因其胰岛较大且密度高，便于细胞收集以验证方法学概念（图2b-c）。关键技术要点包括：以1M蔗糖水溶液替代OCT包埋剂以兼容质谱检测；使用Director玻片进行蛋白质组学样本收集，使用PET膜玻片进行转录组学样本收集；针对质谱分析采用“cut and scan”激光切割模式。蛋白质组分析使用timsTOF Pro质谱仪在DIA-PASEF模式下运行，转录组分析则使用SMART-Seq Stranded Kit构建文库并在Illumina NextSeq 500上测序。

**三、主要研究结果**

**1. 图像质量与生物学质量的权衡**：研究人员发现，传统免疫荧光染色流程（含PFA固定、过夜抗体孵育）虽能获得清晰的细胞图像，但提取的RNA降解严重且无法检测到蛋白质。通过改用快速新鲜冷冻、无PFA固定、快速免疫染色并缩短LMD处理时间的优化流程，成功获得了有意义的生物学数据（图1c-d）。该部分研究通过对比不同处理流程得到的结果，明确了快速无固定处理对保留分子完整性的必要性。

**2. 小鼠品系比较**：C57BL/6小鼠胰岛数量少且体积小，而CFW小鼠胰岛面积显著更大（P<0.01，Student's t检验）（图2c），提高了细胞收集效率，因此选用CFW小鼠作为方法学验证的模型（图2a-b）。

**3. 蛋白质组学分析**：通过LMD分离并结合质谱分析，在α细胞中鉴定出660种蛋白质，β细胞中鉴定出1,335种，δ细胞中鉴定出1,765种（图3a）。主成分分析（PCA）显示三种细胞形成明显分离的分子簇（图3b）；热图及树状图分析表明α细胞与δ细胞的分子特征比其与β细胞的更相近（图3c）。值得注意的是，按细胞类型排序后的热图（图3d-f）揭示了β细胞与δ细胞之间存在显著的“负相关”表达模式，即一种细胞高表达的蛋白在另一种细胞中往往低表达，这可能由转录因子MLXIPL驱动。此外，各细胞类型均鉴定出已知的特异性标志物（如α细胞的Gcg和PCSK1，β细胞的Ins2、SLC2A2、ENTPD3和MLXIPL），验证了分离和鉴定的准确性（图3g）。δ细胞虽然以往研究较少，却表现出最高数量的特异性蛋白（图3i-j）。

**4. 转录组学分析**：同样通过LMD分离，转录组分析分别鉴定出α细胞18,394个、β细胞11,696个和δ细胞18,071个转录本（图4a）。PCA和热图分析结果与蛋白质组学数据高度一致，即三种细胞为不同群体，且α与δ细胞的转录特征更为接近（图4b-c）。β与δ细胞之间同样观察到反向表达模式（图4d-f）。除MLXIPL外，还鉴定出Rfx6、Isl1、Zfhx3、Egr1和NeuroD1等转录因子在β与δ细胞间差异表达（图4g）。

**5. 蛋白质组与转录组数据比较**：研究人员开发了一种相对表达值分配方法（相似=1，转录组独有=0.5，蛋白质组独有=-0.5，不同=-1）来比较两种组学数据。比较结果显示，大多数基因和蛋白的排名并不对应（图5a-c），表明RNA水平并不总能反映最终翻译的蛋白水平。原始数据散点图验证了该比较方法的合理性（图5e-g），相似基因和蛋白聚集在趋势线周围，而不同者则散在分布。

**6. 与文献数据的比较**：研究人员将自己的转录组和蛋白质组数据与van Gurp等人（采用酶解+FACS方法）的荟萃分析数据进行比较。即使将差异阈值放宽至|0.45|，仍有大量基因被标记为“不同”（图6a-c），直接证明了细胞分离方法对分子谱读出的显著影响。与Thielert等人（同样采用FACS酶解分离）的单细胞蛋白质组数据比较（仅保留标准差≤0.25的蛋白），也发现大多数蛋白存在差异，其中α细胞差异最大，β细胞相似蛋白最多（补充图2d-f）。

**7. 差异表达基因和蛋白的通路分析**：通过STRING分析（图7），研究人员将在非酶解数据集中被鉴定为“不同”且高表达的基因和蛋白按细胞类型组织为功能性通路：α细胞富集与动作电位调控（尤其是钙信号通路）相关的蛋白（如Calm1、Calm3、Anxa5），这与α细胞感知代谢波动并协调胰高血糖素分泌的生理功能一致；β细胞富集囊泡运输通路相关蛋白，与其胰岛素储存和调节性分泌功能相适应；δ细胞显著表达黏着斑相关通路蛋白，这可能与其通过长细胞质突起与邻近α、β细胞建立广泛接触、发挥旁分泌调节的结构基础相关。

**四、讨论与结论**

本研究的主要贡献在于利用机械性单细胞分离技术成功获得了胰腺内分泌细胞类型的蛋白质组学图谱。以往研究多依赖酶解分散法，这不可避免地造成膜蛋白损失并可能通过激活Par2等受体引发基因表达改变。本研究的非酶解LMD方法则能保留组织的原始结构，避免蛋白质水解，并最大限度地减少分离操作引起的分子状态改变。研究结果证实，细胞分离方法绝不仅仅是技术细节，而是决定所得分子谱的关键因素。与酶解方法相比，机械性分离能够恢复大量膜相关蛋白和通路，这些蛋白在传统数据集中往往缺失或低丰度，而它们在细胞感知微环境、细胞间通讯以及信号整合中发挥核心作用。

值得强调的是，研究人员将差异蛋白组织为通路级特征，揭示了α、β、δ细胞各自的独特功能通路，这比单蛋白测量提供了更深入的生物学理解。此外，β与δ细胞之间的分子反向关系是一个有趣的发现，提示转录调控（如Mlxipl）可能参与塑造这种表达格局。研究还发现α细胞在蛋白质组水平上检测到的蛋白数量远少于β和δ细胞，尽管其转录本数量与δ细胞相当，这暗示α细胞可能存在较低的全局蛋白质合成速率或更强的翻译后调控。

研究的局限在于当前技术尚未达到真正的单细胞分辨率，需要汇集数百个同类型细胞以满足质谱检测灵敏度要求，但这已为将来的单细胞蛋白质组学提供了实用基准。该技术易于扩展至其他小鼠模型（如NOD和Rcs-10糖尿病模型）以及人类供体样本（如nPOD样本），为系统性评估疾病相关的胰岛细胞变化奠定了基础。

**研究结论**：本研究证明，细胞分离策略能够显著影响生物学解读。虽然不同方法各有优势，但当需要优先保留天然分子状态时，无酶LMD技术提供了有力的替代方案。研究人员预期，该技术的应用将提高空间组学分析的准确性，并扩展跨组织和疾病背景下的生物学发现机会。这一框架可用于未来对健康和糖尿病胰岛样本的比较分析，从而促进对胰岛细胞生物学及功能在疾病状态下变化机制的理解。