《Plant Molecular Biology Reporter》：Integrating the Classical and Molecular Approaches Toward Passion Fruit Resistance Against CABMV
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摘要
西番莲是一种在多个国家栽培的热带作物，其种植面积的扩大面临若干限制因素的挑战，其中包括由果实木质化病毒引起的作物完全绝收。在巴西，这种病害由豇豆蚜传花叶病毒（cowpea aphid-borne mosaic virus，CABMV）引起，目前尚无西番
摘要
西番莲是一种在多个国家栽培的热带作物，其种植面积的扩大面临若干限制因素的挑战，其中包括由果实木质化病毒引起的作物完全绝收。在巴西，这种病害由豇豆蚜传花叶病毒（cowpea aphid-borne mosaic virus，CABMV）引起，目前尚无西番莲栽培品种对该病毒具有抗性。本研究将经典育种与分子分析相结合，在Westfalia（Passiflora）回交群体中鉴定CABMV抗性植株，以满足商业西番莲对持久抗性的需求，并提高育种计划的选择效率。本研究旨在采用表型与基因型相结合的方法评价西番莲第三回交世代（BC3）对CABMV的抗性，以鉴定最有潜力的家系和基因型。研究采用随机区组设计和症状分级标准评价病毒症状表现，便于估计病害进展曲线下面积（area under the disease progress curve，AUDPC）。利用混合模型对“抗病性”性状进行分析，通过限制最大似然法（Restricted Maximum Likelihood，REML）估计方差分量，并通过最佳无偏线性预测（Best Unbiased Linear Prediction，BLUP）预测选择增益。采用27个微卫星标记（SSR）测定研究群体中95个基因型之间的遗传距离。这些SSR标记能够有效区分所评价的群体。在CABMV抗性排名前30的基因型中，有4个来自不同家系的基因型表现出优良性状，可作为下一轮回交世代的候选材料。
论文解读
**一、研究背景与问题**
西番莲（Passiflora edulis Sims），俗称百香果，是西番莲科（Passifloraceae）西番莲属中具有重要经济价值的热带果树。该物种在世界多个地区广泛种植，因其较高的市场接受度而具有显著的农业重要性。然而，西番莲栽培面积的扩大面临着诸多挑战，其中由病原物引起的病害可导致作物完全绝收。西番莲易受真菌、病毒和细菌等多种病害的侵染，表现出萎蔫、叶斑和果实腐烂等症状。在巴西，由豇豆蚜传花叶病毒（CABMV）引起的果实木质化病危害尤为严重，严重影响果实品质和商品价值。尽管采取了包括每年更新果园、拔除病株、接种弱毒株系以及使用杀虫剂在内的多种传统防控措施，均未能有效控制该病害。CABMV感染西番莲后产生的症状包括叶片花叶、疱状突起和果实木质化，给生产造成重大经济损失。豇豆蚜（Aphis craccivora）是CABMV的主要自然传播介体，也是西番莲作物中数量最丰富的蚜虫种类。鉴于这一严峻形势，北弗鲁米嫩塞州立大学（Universidade Estadual do Norte Fluminense，UENF）的研究人员于2010年启动了西番莲育种计划，旨在通过栽培种与抗病毒野生种之间的种间杂交，培育具有CABMV抗性的品种。然而，目前尚无商业西番莲品种对CABMV具有抗性，因此开展该项研究以培育具持久抗性的商业品种，并提高育种计划的选择效率，具有重要意义。
**二、研究内容与结论**
该研究整合经典育种与分子分析方法，对西番莲第三回交世代（BC3）群体进行了CABMV抗性评价。研究采用随机区组设计，评价了5个回交家系共95个基因型。通过定期症状调查和病情进展曲线下面积（AUDPC）计算进行表型鉴定，同时利用27个微卫星（SSR）标记开展分子分析，估算了群体内基因型间的遗传距离，并通过贝叶斯方法分析了群体遗传结构。混合模型分析结果表明，CABMV抗性受多基因控制，呈现数量遗传特征，家系平均遗传力较高，选择准确性达到97%，表明基于家系表现的选择策略能获得显著的遗传进展。SSR标记有效区分了所评价的西番莲基因型，揭示了群体内的遗传分化。综合表型和分子数据，从排名前30的抗性基因型中筛选出4个来自不同家系的优良基因型，其AUDPC值低且与商业栽培种的遗传相似度较高，可作为下一轮回交世代的候选亲本。
**三、主要技术方法**
该研究于巴西里约热内卢州Campos dos Goytacazes的Ant?nio Sarlo农业学校试验基地开展，供试群体由UENF西番莲育种计划前期获得BC3世代5个家系（BC3?17、BC3?153、BC3?293、BC3?355和BC3?501）的95个基因型组成，同时纳入抗性亲本P. setacea和感病亲本P. edulis作为对照。研究采用随机区组设计，在自然发病条件下通过分级量表定期评价病毒症状，计算AUDPC。利用混合模型通过限制最大似然法（REML）估计遗传参数，通过最佳无偏线性预测（BLUP）预测遗传增益。分子分析采用27对微卫星（SSR）标记对92个BC3基因型及对照样本进行扩增，基于等位基因数据计算遗传距离，并分别运用UPGMA聚类和STRUCTURE软件贝叶斯聚类分析群体遗传结构。
**四、主要研究结果与讨论**
**症状严重度（Symptom Severity）**
田间症状观察显示，定植后30天即可在部分基因型中检测到首批CABMV症状。随着时间推移，至150天时几乎所有P. edulis基因型均表现症状，而P. setacea在240天后仅有少数基因型表现轻微症状，说明其具有较高水平的抗病性。至评价结束时，所有植株均表现出不同程度的症状。由于回交世代的推进，群体与轮回亲本P. edulis的遗传相似度不断提高，使基因型间重组概率降低，从而增加了筛选无症基因型的难度。
**遗传参数估计与增益（Estimates of Genetic Parameters and Gains）**
AUDPC均值在供试基因型间变异较大，从371.25到1076.25不等。抗性表现最佳的基因型主要来自P. setacea及BC3?293家系中的部分个体。混合模型分析（REML）检测到显著的基因型差异（1%概率水平的卡方检验），证实了研究群体中存在可供选择的遗传多样性。个体狭义遗传力估计值较低，符合多基因数量性状受环境影响的特征；而基于家系平均的遗传力高达0.95，表明基于家系表现进行选择最为有效。选择准确性估计值为97%，远高于70%的推荐阈值，表明预测值具有较高可靠性。按BLUP预测的加性遗传值进行排序，获得30个具有最低AUDPC预测值的基因型，其加性遗传值介于?103.73至?74.28之间，预测增益为?7.85%至?2.98%。其中，BC3?293家系的450号植株表现最优（AUDPC=397.5），且具有最高的遗传 merit，表明回交策略结合大规模后代评价和多基因抗性选择能够有效转移CABMV抗性基因。
**基于UPGMA的遗传距离分析（Dissimilarity Through UPGMA）**
基于27个SSR标记的加权指数遗传距离矩阵，采用UPGMA法构建系统树（CCC=0.84），在80%相异度阈值下可将95个基因型划分为4个类群。P. setacea作为种间差异最大的材料单独聚为一类，与P. edulis之间遗传距离最大（0.57）。第二个类群仅包含一个AUDPC值为495的BC3基因型，第三个类群仅包含一个AUDPC值为952.5的敏感基因型，其余92个基因型（96.8%）共同构成第四个类群，其中包括商业栽培种P. edulis。第四类群内基因型间具有较高的等位基因共享度，AUDPC均值范围从397.5至990。最抗病的基因型主要来自BC3?293家系，其中450号植株与商业品种的遗传相似度达0.77，兼具有利抗性基因和较高的轮回亲本基因组恢复度，是理想的下轮回交亲本。
**亲本基因组贡献分析与群体遗传结构（Analysis of Parental Genome Contribution and Population Genetic Structure）**
通过计算各基因型与轮回亲本'UENF Rio Dourado'相同位点数占总位点数的比例，估算基因组恢复度。理论上BC3世代轮回亲本基因组平均贡献应为93.75%，但实际观测值仅为72.36%。在各家系中，BC3?153家系具有最高的轮回亲本基因组恢复度（平均74.48%），而BC3?501家系最低（69.48%），反映了回交过程中供体染色体片段的保留和重组变异。贝叶斯遗传结构分析（STRUCTURE）根据ΔK方法确定最适群体分组数为K=2，将95个基因型划分为两个遗传结构清晰的类群。第一类群包含67个基因型（70.5%），包括商业栽培种和一个回交亲本；第二类群包含28个基因型，其中包含野生抗性亲本P. setacea。两类群间AUDPC均值相近（分别为642.75和656.8），但第二类群具有独特的等位基因组合，构成了区别于主群体的遗传变异来源。两种聚类结果相互补充，为后续回交育种中亲本选配提供了重要的分子依据。
**五、讨论与结论**
抗性育种受限于多年生作物较长的世代周期、大规模分离群体评价的劳动力密集型表型鉴定和分子筛选需求，以及症状表现在不同植株和接种条件下可能存在的差异。尽管如此，该研究表明，即使在BC3阶段轮回亲本基因组尚未完全恢复的情况下，利用SSR分子标记辅助选择仍能有效鉴定集抗病性与农艺性状于一体的优良基因型。研究获得的重要结论包括：估算的个体狭义遗传力和家系平均遗传力均支持进行家系内选择，有助于鉴定优异个体；在30个CABMV抗性评价基因型中，450、476、340和389号基因型具有最佳选择增益和最低AUDPC均值，是纳入下一轮回交世代的理想候选材料；本研究所采用的SSR标记能有效刻画西番莲基因型的遗传结构，并鉴定出既抗病又与商业栽培品种高度相似的基因型（编号为25、45、46、53、62、65、66和88，对应田间植株165、340、345、389、450、475、476和675）。尽管回交策略能够鉴定出CABMV抗性个体，但西番莲抗病育种仍受多年生作物世代周期长、需评价大型分离群体、表型和分子筛查耗费大量人力物力等限制，且不同植株和接种条件下症状表现可能存在差异，具有广谱抗性的商业材料仍十分有限，因此持续进行抗性基因渐渗和抗性验证对于推动育种进展至关重要。该研究发表于《Plant Molecular Biology Reporter》。
