柑橘（Citrus sinensis）果渣甲醇提取物组分与生物防治剂在大豆根结线虫（Meloidogyne javanica）防治中的相容性

《BioControl》：Compatibility of methanolic extract fractions of Citrus sinensis pomace with biological agents for managing the root-knot nematode Meloidogyne javanica in soybean

　　

摘要

农业工业废弃物因其丰富的植物化学成分而在植物线虫防治研究中日益受到关注。然而，这些废弃物也可能影响用作生物防治剂的有益微生物。本研究评价了来自柑橘（Citrus sinensis (L.) Osbeck）果渣的提取物组分单独使用或与杀线虫剂联合使用对大豆中爪哇根结线虫（Meloidogyne javanica (Treub, 1885) Chitwood）繁殖的影响，并评估了其与生物防治剂的体外相容性及对卵寄生作用的影响。温室繁殖试验采用了基于淡紫紫孢菌（Purpureocillium lilacinum (Thom) Luangsa-ard, Houbraken, Hywel-Jones and Samson）＋厚垣普奇尼亚菌（Pochonia chlamydosporia (Goddard) Zare and Gams）、坚强芽孢杆菌（Bacillus firmus Bredemann and Werner）和阿维菌素（abamectin）的商品制剂，以1.5%（m/v）浓度制备的粗甲醇提取物的乙酸乙酯组分（EAF）和二氯甲烷组分（DCMF）存在与否进行处理，并设未处理对照。在微生物生长试验中，研究人员从商品制剂中分离微生物，并在有无EAF和DCMF的条件下进行培养。通过将M. javanica卵与食线虫真菌在有或无组分条件下共培养来评估卵寄生率。EAF和DCMF单独施用可降低大豆中M. javanica的繁殖，且不改变杀线虫剂的防治效果。相反，各组分（尤其是EAF）降低了P. chlamydosporia和P. lilacinum的菌丝生长和产孢量，降低了B. firmus的活力，且其与真菌处理组合时降低了卵寄生率。然而，当提取物组分与杀线虫剂联合施用时，并未影响大豆中M. javanica的防治效果。

柑橘果渣提取物组分与生物防治剂在大豆根结线虫防治中的相容性研究解读

一、研究背景与意义

柑橘产业废弃物作为植物线虫可持续治理的潜在资源，近年来受到广泛关注。植物寄生线虫，尤其是根结线虫（Meloidogyne spp.），对全球农业生产造成严重经济损失。在巴西，线虫相关年损失估计达114亿美元，其中大豆一项即占48亿美元。爪哇根结线虫（Meloidogyne javanica）是巴西大豆栽培中危害最严重的线虫属之一。前期研究已证实，柑橘（Citrus sinensis）果渣甲醇提取物的乙酸乙酯组分（EAF）和二氯甲烷组分（DCMF）可有效降低M. javanica在大豆上的繁殖，尤以种子处理方式施用效果显著。化学成分分析表明，上述组分富含酚酸类（如阿魏酸、香豆酸、羟基苯甲酸、原儿茶酸）和黄酮类化合物（如柚皮素、圣草酚、橙皮素、槲皮素），这些次生代谢物具有良好的杀线虫活性。

然而，一个关键问题亟待解答：这些具有杀线虫潜力的植物源化合物是否会影响用于生物防治的有益微生物？当前综合线虫管理策略日益强调多种防治手段的协同整合，其中食线虫真菌——淡紫紫孢菌（Purpureocillium lilacinum）和厚垣普奇尼亚菌（Pochonia chlamydosporia）以及细菌制剂坚强芽孢杆菌（Bacillus firmus）均通过卵寄生、拮抗和竞争等不同机制发挥生防作用。鉴于酚酸和黄酮类化合物同时具有广谱抗菌活性，可能影响微生物的膜完整性、细胞代谢和氧化平衡，因此有必要系统评估柑橘果渣提取物组分与商业生防制剂的相容性。本研究正是基于这一科学假设开展，旨在探究提取物组分能否在不损害生物防治剂效能的前提下协同防治根结线虫。

二、技术方法概述

研究采用多维度评价体系：温室繁殖试验在巴西巴拉那州马林加州立大学（UEM）实验基地进行，供试大豆品种为BMX Fibra IPRO，接种2,000个M. javanica卵及二龄幼虫，设置4×3（杀线虫剂×提取物组分）因子试验，含6次重复；体外相容性试验分别采用PDA和TSA培养基评价真菌菌丝生长、产孢量及细菌活力；卵寄生试验参照Vilchis-Martínez等方法，以6.0×10? conidia ml?1的真菌孢子悬液与1,000个线虫卵在27℃、120 rpm振荡条件下共培养24和48小时。数据采用Shapiro-Wilk正态性检验后进行方差分析，均值比较采用Scott-Knott检验（P <0.05）。

三、主要研究结果

（一）提取物组分与杀线虫剂对M. javanica繁殖及大豆发育的联合效应

在两个独立试验中，提取物组分与杀线虫剂的互作效应对线虫总数和单位根重线虫密度均达到显著水平。各杀线虫剂单用均可显著降低线虫总数，其中阿维菌素在试验2中表现出最高的防治效果。单独施用EAF和DCMF分别使线虫总数降低35.2%和44.6%（试验1）以及68.4%和57.6%（试验2）。关键发现是，将提取物组分与任何杀线虫剂组合施用均不影响后者的防治效果，既未产生拮抗也未呈现协同增效。在植物发育指标方面，提取物组分与杀线虫剂的组合对地上部干重和根鲜重产生显著影响，但未一致改变大豆生长表现。

（二）提取物组分对生防微生物的体外相容性

体外试验表明，EAF和DCMF均显著抑制P. chlamydosporia和P. lilacinum的菌落扩展。从培养第2天起，EAF持续产生最小的菌落直径，DCMF次之，二者均显著低于对照组。对照处理的P. chlamydosporia平均菌落生长速率为3.15 mm day?1，DCMF处理降至2.50 mm day?1，EAF处理进一步降至1.80 mm day?1。P. lilacinum呈现相似趋势，生长速率由对照的3.12 mm day?1降至DCMF的2.24 mm day?1和EAF的1.60 mm day?1。产孢量分析显示，EAF对两种真菌产孢的抑制最为显著，P. chlamydosporia和P. lilacinum分别降至0.50×10?和0.46×10? conidia plate?1（试验1），远低于对照的1.24×10?和1.28×10? conidia plate?1。在细菌活力测定中，EAF和DCMF在24、48、72小时三个时间点均显著降低了B. firmus的菌落形成单位（CFU），在试验1中24小时时EAF的抑制作用显著强于DCMF。

（三）提取物组分对食线虫真菌卵寄生能力的影响

卵寄生试验结果显示，在24和48小时两个评价时间点，真菌种类与提取物组分之间均存在显著互作。与单独施菌相比，将P. lilacinum或P. chlamydosporia与EAF或DCMF组合处理均显著降低了线虫卵寄生率。总体而言，P. lilacinum的卵寄生能力高于P. chlamydosporia，尤其是在有提取物组分存在的条件下更为明显。

四、讨论与结论

本研究表明，虽然EAF和DCMF在体外条件下显著抑制生防真菌的菌丝生长、产孢和卵寄生能力，并降低生防细菌的活力，但将其与商品杀线虫剂联合用于大豆种子处理时，并未削弱对M. javanica的防治效果。这种体外与体内结果的差异可能归因于多方面的因素：种子处理后化合物在根际环境中被稀释、吸附于土壤颗粒或被微生物降解，使实际接触生防菌的有效浓度大幅降低；同时，提取物组分对线虫的直接毒性作用可能弥补了生防菌活性下降所造成的影响。

值得关注的是，本试验中阿维菌素与EAF组合导致大豆地上部干重显著降低，提示可能存在植物毒性效应，这一发现对实际应用具有警示意义。研究也存在一定局限性：未对单体化合物进行分离定量，未直接测定膜损伤、氧化应激、分生孢子萌发和裂解酶活性等指标，因此所提出的抑制机制应视为合理的生物学假说。

综上所述，本研究为柑橘果渣提取物组分在综合线虫管理中的应用提供了重要科学依据：EAF和DCMF具备抑制M. javanica的潜力，且在实际种子处理条件下与常用杀线虫剂具有操作层面的兼容性。然而，在商业化应用前仍需系统开展制剂稳定性、保质期、剂量效应关系、施用方式与时机以及田间条件下与微生物制剂的互作研究。分次或顺序施用以及控释制剂可能是减少生防菌直接暴露于提取物组分的可行策略。本研究同时揭示了相容性相关的限制因素，为开发更安全、更有效的综合线虫管理组合方案奠定了理论基础。