《In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal》：Derivation and characterization of an embryonic?derived muscle progenitor cell line from Atlantic salmon (Salmo salar)
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与哺乳动物不同，真骨鱼类表现出终身性的骨骼肌生长，其特征为持续的肌纤维肥大以及由持久存在的祖细胞群维持的新肌纤维形成。然而，对于大西洋鲑（Salmo salar）等具有重要商业价值的物种，稳定肌肉祖细胞系的有限可用性制约了机制性研究及细胞水产养殖中的新兴应用。
与哺乳动物不同，真骨鱼类表现出终身性的骨骼肌生长，其特征为持续的肌纤维肥大以及由持久存在的祖细胞群维持的新肌纤维形成。然而，对于大西洋鲑（Salmo salar）等具有重要商业价值的物种，稳定肌肉祖细胞系的有限可用性制约了机制性研究及细胞水产养殖中的新兴应用。本研究报道了一种新型胚胎来源大西洋鲑肌肉祖细胞系（命名为SsEC）的建立与特征鉴定。这些细胞来源于胚胎晚期阶段，在明确的培养条件下表现出纺锤形形态、强大的增殖能力以及超过30代的持续扩增能力。SsEC表现出独特的细胞外基质偏好，其中玻璃粘连蛋白（vitronectin）支持其长期维持与扩增。分子特征鉴定确认了典型生肌标志物（包括myf5和myod1）的稳定表达，而转录组学分析显示，与非肌源性大西洋鲑细胞系相比，SsEC富集了与肌肉发育和肌节组织相关的基因。采用两步法方案进行定向肌肉分化，可诱导表达肌球蛋白重链（myosin heavy chain）和肌节型α-辅助动蛋白（sarcomeric α-actinin）的多核肌管高效形成，并伴有myog和tnnt3a等关键分化标志物的上调。综上所述，这些发现确立了SsEC作为研究大西洋鲑肌肉发育的稳健体外模型细胞系，并为水产养殖研究和细胞海鲜生产提供了新型平台。
论文解读：大西洋鲑胚胎来源肌肉祖细胞系的建立与特征鉴定
**一、研究背景与研究意义**
骨骼肌构成了真骨鱼类体重的主要部分，在运动、代谢和水产养殖产量中发挥核心作用。与哺乳动物不同，真骨鱼类表现出不确定生长（indeterminate growth），其肌肉质量在整个生命过程中通过驻留的肌原性祖细胞（myogenic progenitor cells）驱动的肌纤维肥大（hypertrophy）和持续增生（hyperplasia）而不断增加。这种独特的生长策略使鱼类肌肉成为研究脊椎动物肌生成（myogenesis）以及开发细胞基海鲜平台的理想体系。然而，尽管取得了一定进展，硬骨鱼肌肉发育的机制理解仍不完整，尤其是在早期祖细胞群体及其体外行为方面。目前，鱼类肌肉细胞培养相较于哺乳动物系统仍相对滞后且分散，早期研究主要依赖原代卫星细胞培养，但该方法受限于供体变异性、有限的增殖能力以及不一致的分化结果。虽然近年来已有少数研究报道了来自鲭鱼、黑棘鲷、石斑鱼、鲈鱼和金鱼等物种的连续或长期传代肌肉细胞系，但来自大西洋鲑（Salmo salar）等商业重要物种的稳定肌肉祖细胞系仍然稀缺。此外，细胞水产养殖（cellular aquaculture）这一新兴领域的出现，进一步凸显了对具备自我更新能力和受控分化能力的充分表征、可规模化细胞来源的需求。因此，开展本研究旨在建立并系统鉴定一种来源于大西洋鲑胚胎的肌肉祖细胞系，以填补该领域的空白，为研究早期鱼类肌生成及细胞水产养殖应用提供关键平台。
**二、研究内容与主要结论**
研究人员从大西洋鲑眼囊期（eyed-stage）胚胎中分离细胞，通过筛选不同的细胞外基质（extracellular matrix, ECM）底物，成功建立了一株胚胎来源的肌肉祖细胞系，命名为SsEC。研究发现，玻璃粘连蛋白（vitronectin）是支持SsEC长期维持和扩增的关键ECM成分，而明胶（gelatin）和层粘连蛋白（laminin）均无法支持其持续生长。SsEC表现出纺锤形形态和快速增殖能力，倍增时间约为54小时，显著快于已建立的大西洋鲑肾脏（ASK）细胞系（约120小时）。转录组分析显示，SsEC与ASK细胞在转录水平上存在显著分离，SsEC富集了与肌生成、肌节组织和细胞骨架重构相关的基因程序，而ASK细胞则高表达内皮和肾脏相关基因。通过两步法定向分化方案（先诱导前体节中胚层（PSM）样状态，再进行肌源性分化），研究人员成功诱导SsEC形成表达肌球蛋白重链（MHC）和肌节型α-辅助动蛋白（SAA）的多核肌管，并伴随myod1、myog和tnnt3a等关键分化标志物的显著上调。此外，研究还发现，来源于囊胚期（blastula-stage）胚胎的细胞在层粘连蛋白上形成ESC样集落，但在玻璃粘连蛋白上无法附着，揭示了不同胚胎发育阶段细胞对ECM的依赖性存在显著差异。
**三、关键技术与方法**
研究人员采用了以下主要技术方法：①从Benchmark Genetics（挪威卑尔根）获取大西洋鲑受精卵（StofnFiskur Salmoselect，二倍体混合性别），在约4.5°C充气淡水中孵育至目标发育阶段，分别收集眼囊期（约370 B-DDG）和囊胚期（约40–48 B-DDG）胚胎；②胚胎组织解离后，分别接种于明胶、层粘连蛋白-511和玻璃粘连蛋白包被的培养表面，在20°C、5% CO?条件下培养，并通过Accutase消化传代；③通过RT-qPCR检测生肌标志物（myf5、myod1、myog、tnnt3a等）和内皮标志物（vwf、pecam1、kdr等）的表达；④利用Illumina NovaSeq 6000平台进行bulk RNA测序（RNA-seq），通过STAR比对至大西洋鲑参考基因组（Ensembl Ssal_v3.1），并使用edgeR进行差异表达分析，结合clusterProfiler进行GO和KEGG通路富集分析；⑤采用两步法分化方案：先用CHIR99021（WNT激活剂）、SB431542（TGF-β抑制剂）和DMH1（BMP抑制剂）组合处理2天诱导PSM样状态，再分别使用含KSR或无血清/低血清培养基（含IGF-1、HGF、bFGF）进行17天的肌源性分化；⑥通过免疫细胞化学（ICC）检测肌管中肌球蛋白重链（MHC；克隆MF20）和肌节型α-辅助动蛋白（SAA；克隆EA-53）的表达。
**四、研究结果**
**（一）细胞外基质组成决定大西洋鲑胚胎祖细胞的成功建立和长期扩增**：研究人员通过比较不同ECM底物上的细胞附着和增殖行为，发现明胶仅支持短暂附着后培养失败，层粘连蛋白虽支持初始附着和增殖但无法持续传代，而玻璃粘连蛋白支持细胞连续扩增超过60天和30代以上。这一结果表明，玻璃粘连蛋白是成功建立胚胎来源大西洋鲑肌肉祖细胞的关键ECM成分。
**（二）SsEC表现出加速的生长动力学和独特的细胞形态**：与ASK细胞相比，SsEC呈纺锤形祖细胞样形态，而ASK细胞呈铺路石样上皮形态。生长动力学分析显示，SsEC的群体倍增时间（约54小时）显著短于ASK细胞（约120小时），证明SsEC具有更强的增殖能力，符合快速扩增祖细胞群体的特征。
**（三）转录组分析揭示SsEC中富集的肌肉骨骼程序**：主成分分析（PCA）显示SsEC与ASK细胞在转录组水平上完全分离（PC1占84.27%变异），且SsEC在不同传代（p8和p32）之间聚类紧密，表明其转录组稳定性。差异表达分析鉴定出大量差异表达基因，其中SsEC中上调的基因显著富集于肌肉发育、肌节组织、肌原纤维装配和细胞骨架组织等生物学过程。RT-qPCR验证确认，SsEC在传代过程中稳定高表达myf5、acta1、tpm1和tnnt3a等生肌标志物，而内皮标志物vwf、pecam1和kdr仅在ASK细胞中高表达。
**（四）定向分化产生形成肌节的肌管并表达MHC和α-辅助动蛋白**：通过两步法分化方案（先PSM诱导，再进行肌源性分化），研究人员发现在血清-free条件（C1；MN1/MN2）和低血清条件（C2；MS1/MS2）下，SsEC均能显著上调myod1（约3000倍以上）和myog（约28000倍以上）表达。免疫细胞化学检测证实，分化后的肌管呈MHC和SAA阳性，且C1条件下tnnt3a表达更高（约11.8 log?FC），表明血清-free环境可能更有利于晚期肌原纤维发生。两种条件均能有效诱导SsEC分化为多核肌管。
**（五）囊胚来源的ESC样集落需要独特的ECM用于附着和扩增**：研究人员从囊胚期胚胎中分离的细胞表现出与SsEC完全不同的ECM依赖性——它们仅在层粘连蛋白上形成紧密、高核质比的ESC样集落，而在玻璃粘连蛋白和Geltrex上完全无法附着或形成集落。这一结果揭示了大西洋鲑胚胎发育过程中从早期全能/多能细胞向谱系限制性中胚层祖细胞转变时ECM需求的阶段特异性变化。
**五、讨论与结论**
本研究表明，SsEC作为一种胚胎来源的肌肉祖细胞系，具有强大的长期扩增能力和受控的肌源性分化能力，解决了鱼类肌肉细胞生物学和水产养殖相关体外模型中的关键瓶颈。研究证实，ECM依赖性在鱼类胚胎细胞中具有阶段特异性和功能重要性——玻璃粘连蛋白选择性地支持晚期中胚层来源的祖细胞，而层粘连蛋白则仅支持更早期的囊胚来源细胞。转录组稳定性是SsEC的另一大优势，早期和晚期传代之间转录组差异极小，表明其具有谱系限制性的肌肉祖细胞身份且不会发生转录漂移。功能上，SsEC通过模拟脊椎动物肌生成信号逻辑的两步法分化方案，成功形成了带有肌节结构的多核肌管，确认了其结构成熟和收缩机器的装配能力。研究还发现囊胚期细胞表现出ESC样形态且依赖层粘连蛋白，与大西洋鲑胚胎发生中从早期多能细胞向谱系限制性中胚层祖细胞的发育转变一致。未来研究将通过体内移植实验和多组学分析（包括单细胞转录组学和表观基因组学）进一步揭示调控祖细胞维持、谱系定向和终末分化的调控网络。总之，SsEC的建立为比较发育生物学、水产养殖应用研究以及新兴细胞海鲜技术提供了一个多功能平台。
