《Frontiers in Immunology》：Multi-omics integration reveals macrophage polarization and ferroptosis as key mechanisms underlying kaempferol’s therapeutic efficacy in peripheral artery disease
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外周动脉疾病（peripheral artery disease, PAD）是一种以血管闭塞和代谢-免疫失调为特征的慢性缺血性疾病。为阐明PAD的分子机制及山奈酚（Kaempferol）的治疗效应，研究人员整合了批量转录组学、单细胞RNA测序、网络药理学及实验
外周动脉疾病（peripheral artery disease, PAD）是一种以血管闭塞和代谢-免疫失调为特征的慢性缺血性疾病。为阐明PAD的分子机制及山奈酚（Kaempferol）的治疗效应，研究人员整合了批量转录组学、单细胞RNA测序、网络药理学及实验验证。转录组学分析在PAD中鉴定出1，144个差异表达基因，提示广泛的转录重塑。加权基因共表达网络分析（WGCNA）揭示了与PAD显著相关的不同基因模块，提示与血管炎症和免疫失调相关的关键网络。网络药理学鉴定出山奈酚为临床上治疗PAD有效的软坚清脉方（Ruan Jian Qing Mai formula）的核心活性成分，其靶向87个PAD相关基因，这些基因富集于免疫和炎症通路，主要在巨噬细胞中表达。将RNA-seq获得的山奈酚相关靶点与多数据库预测整合，发现了70个参与巨噬细胞活化、脂质代谢和动脉粥样硬化信号传导的重叠靶点。CIBERSORTx和单细胞分析进一步确定巨噬细胞是主要的细胞介质，山奈酚靶基因（如TNF、SYK、LCK、IL4I1）在巨噬细胞中特异性富集。巨噬细胞被分为高炎症和低炎症亚群；PAD病灶表现出高炎症巨噬细胞的显著富集，这些细胞同时显示出升高的炎症特征和增强的铁死亡转录活性，并且是对山奈酚响应的主要细胞群体。计算机模拟基因敲除分析进一步验证了SYK和SNX5是巨噬细胞中核心的免疫信号调节因子，而TNF和LCK缺乏巨噬细胞特异性的免疫调节功能。功能实验证实，山奈酚显著抑制了脂多糖（LPS）诱导的RAW264.7细胞M1巨噬细胞极化和炎症细胞因子表达。铁死亡评分显示PAD巨噬细胞的铁死亡易感性增强，且山奈酚靶基因与铁死亡驱动因子呈正相关。分子对接进一步验证了山奈酚与关键巨噬细胞相关靶点（IL4I1、LCK、TNF、SYK）之间具有强结合亲和力。利用斑马鱼血管再生损伤模型，研究人员进一步验证了高剂量山奈酚在血管缺血性损伤下可挽救受损的血管生成。综上，这些多组学和实验发现揭示了巨噬细胞极化和铁死亡调节是山奈酚在PAD中发挥治疗作用的核心机制，为精准干预提供了机制性见解和潜在分子靶点。
**论文解读：多组学整合揭示山奈酚治疗外周动脉疾病的巨噬细胞极化与铁死亡机制**
**一、研究背景与科学问题**
外周动脉疾病（peripheral artery disease, PAD）是一种常见的慢性缺血性循环系统疾病，以动脉粥样硬化导致的肢体动脉狭窄或闭塞为主要病理特征。该疾病严重影响患者的生活质量，增加心血管不良事件风险。尽管现有的治疗手段包括生活方式干预、药物治疗和外科手术，但许多患者仍面临疗效不足的困境，且当前疗法未能从根本上解决PAD复杂的病理生理机制。近年来，炎症和免疫细胞动力学在PAD发病中的作用受到广泛关注，特异性生物标志物的鉴定为疾病机制研究和靶向治疗开发提供了新方向。然而，关键分子通路在不同细胞区室间的交互作用及其对PAD进展的贡献尚缺乏系统理解。天然化合物对失调通路的治疗潜力，特别是以巨噬细胞为中心的机制，亟待深入探究。山奈酚（kaempferol）是一种具有抗炎和抗氧化特性的天然黄酮类化合物，既往研究提示其对心血管疾病具有保护作用，但其在PAD复杂微环境中的精确分子机制尚不清楚。基于此，该研究采用整合多组学生物信息学框架，旨在系统解析PAD的分子机制，并阐明山奈酚治疗PAD的核心作用机制。
**二、研究内容概述**
该研究通过整合批量转录组学、单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）、网络药理学和实验验证，系统探讨了山奈酚治疗PAD的分子机制。研究发现巨噬细胞极化和铁死亡调节是山奈酚发挥治疗作用的核心机制，为PAD的精准干预提供了新的潜在分子靶点。该论文发表于《Frontiers in Immunology》。
**三、主要技术方法**
该研究主要采用了以下关键技术方法：（1）对GEO数据库中人PAD动脉批量转录组数据（GSE100927，14例PAD与11例对照，均来自膝下动脉队列）进行差异表达分析和加权基因共表达网络分析（weighted gene co-expression network analysis, WGCNA）；（2）利用HERB、NetInfer和SwissTargetPrediction数据库筛选软坚清脉方（Ruan Jian Qing Mai formula, RJQM）吸收成分靶点，结合山奈酚处理小鼠转录组数据（GSE145665）构建药物靶点集；（3）使用CIBERSORTx工具进行免疫浸润分析；（4）对人PAD骨骼肌scRNA-seq数据（GSE233882，3例PAD与2例对照）进行质量控制、批次效应校正、UMAP降维聚类及层次定向WGCNA（hdWGCNA）分析；（5）利用scTenifoldKnk进行计算机模拟基因敲除；（6）采用UCell算法计算铁死亡及炎症基因特征评分；（7）通过CB-Dock2服务器进行分子对接；（8）利用RAW264.7细胞进行体外功能验证实验；（9）构建斑马鱼血管再生损伤（VRI）模型进行体内验证。
**四、研究结果**
**1. PAD中差异表达基因的鉴定。** 对GSE100927动脉转录组数据集的分析揭示了PAD患者与健康对照相比深刻的基因表达改变。共鉴定出1，144个差异表达基因（|fold change| ≥ 1.5且FDR < 0.05），其中728个基因上调，416个基因下调。HMGA1P4、MARCKS和MYOC显著上调，而PLAA、PPP1R9A和CHODL下调。主成分分析进一步证实了PAD组与对照组之间明显的转录组图谱差异。
**2. WGCNA揭示PAD相关基因模块。** WGCNA分析确定了多个与疾病状态显著相关的基因模块。其中turquoise模块（2，505个基因）与PAD呈强正相关（r=0.86， p=4e-08），blue模块（1，154个基因）与PAD呈强负相关（r=-0.79， p=3e-06），提示这些模块涵盖了驱动疾病进展或保护性反应的关键生物学过程。
**3. 网络药理学鉴定山奈酚为RJQM治疗PAD的核心活性成分。** 从多数据库共获取RJQM吸收成分的1，026个潜在靶点，与PAD差异表达基因取交集得到87个重叠靶点。KEGG通路富集显示这些基因显著参与NF-κB信号、白细胞跨内皮迁移、Fc γ受体介导的吞噬及脂质和动脉粥样硬化等免疫炎症通路。组织表达富集分析表明这些靶点主要在巨噬细胞中表达。成分-靶点网络构建显示山奈酚具有最高的度值，提示其为RJQM治疗PAD的关键生物活性化合物。
**4. 山奈酚靶点的获取与整合。** 分析GSE145665数据集（山奈酚处理的高脂饮食小鼠）鉴定出631个差异表达基因，包括254个上调和377个下调基因。将这些差异表达基因与HERB、SwissTargetPrediction和NetInfer数据库的预测靶点合并，得到807个独特的山奈酚相关靶点。
**5. 山奈酚治疗PAD的靶点、功能及巨噬细胞相关分子机制。** 将PAD相关基因与山奈酚靶点取交集得到70个重叠靶点。通路分析富集到脂质和动脉粥样硬化、肥厚型心肌病及IL26信号等通路。蛋白-蛋白相互作用网络分析确定TNF、MMP9、PPARG、CD36和CCR5为高度连接的核心节点。组织表达富集分析显示"巨噬细胞"是这70个靶点最显著富集的条目。
**6. 免疫浸润图谱及巨噬细胞中心机制。** CIBERSORTx分析显示PAD动脉与对照相比免疫景观显著改变，γδT细胞、单核细胞和M0巨噬细胞是区分PAD的关键浸润细胞类型。细胞类型特异性富集分析确定了8个在巨噬细胞中显著富集的山奈酚-PAD靶点（TNF、RTP4、IL4I1、HHEX、SNX5、KCNE3、LCK、SYK）。相关性分析显示其中多个靶点与γδT细胞浸润显著相关。
**7. 单细胞转录组解析PAD骨骼肌细胞异质性。** 对GSE233882数据集的非监督聚类鉴定出13个细胞簇，包括内皮细胞、成纤维细胞、I型/II型肌纤维、杂交细胞、巨噬细胞、肌肉干细胞、肌细胞、神经肌肉接头相关肌纤维和卫星细胞。PAD组织中细胞组成发生显著变化，巨噬细胞浸润在PAD样本间表现出显著的异质性。
**8. 山奈酚靶点在PAD骨骼肌单细胞转录组中的表达分析。** 表达分析显示CD36、PRKCH、SYK和NLRC5等多个关键靶点主要在PAD微环境的巨噬细胞和内皮细胞中表达，证实了巨噬细胞和内皮细胞是山奈酚靶点发挥作用的關鍵部位。
**9. hdWGCNA鉴定与PAD巨噬细胞极化相关的基因模块。** hdWGCNA分析确定了blue和turquoise两个关键模块。blue模块基因显著富集于巨噬细胞极化（M1和M2状态）和免疫系统过程相关条目，包含CD163、SYK、MRC1和F13A1等关键巨噬细胞相关基因。
**10. 山奈酚体外抑制LPS诱导的炎症和M1极化。** 体外实验表明，脂多糖处理后RAW264.7细胞显著上调IL-6、IL-1β、iNOS和TNF-α的mRNA表达，增加一氧化氮产生，并增强M1标志物CD86的表面表达。山奈酚处理显著抑制了所有这些炎症标志物的上调，减少了一氧化氮产生，并明显降低了CD86阳性率。
**11. PAD中铁死亡驱动评分及与山奈酚巨噬细胞靶基因的相关性。** 铁死亡评分显示肌细胞、巨噬细胞和神经肌肉接头相关纤维具有最高的铁死亡标志物评分。巨噬细胞中铁死亡驱动评分显著高于抑制评分，提示其在PAD中具有铁死亡易感性倾向。在PAD条件下，血管铁死亡评分与M2巨噬细胞浸润评分显著负相关。巨噬细胞内铁死亡驱动评分与TNF、SNX5、LCK和SYK等关键山奈酚靶点的表达水平显著正相关。计算机模拟基因敲除显示，SNX5和SYK敲除富集到免疫受体和B细胞活化信号级联通路，而TNF和LCK仅得到与横纹肌收缩相关的技术性伪影通路，表明SNX5和SYK在人类PAD巨噬细胞中发挥真实的免疫调节功能。
**12. PAD巨噬细胞炎症分层揭示山奈酚的细胞靶点。** 条件分布分析显示PAD来源的巨噬细胞在高炎症亚组中显著富集（57.8%对41.1%）。高炎症巨噬细胞表现出显著升高的铁死亡驱动评分，炎症评分与铁死亡驱动评分呈正相关。山奈酚复合评分在高炎症巨噬细胞中显著降低，并与炎症评分和铁死亡驱动评分均呈负相关，表明山奈酚抑制的转录程序在高炎症巨噬细胞中被优先激活。
**13. 分子对接验证山奈酚与巨噬细胞相关靶点的结合。** 分子对接显示山奈酚与IL4I1结合亲和力最强（ΔG=-9.2 kcal/mol），其次为TNF（ΔG=-8.9 kcal/mol）、LCK（ΔG=-8.4 kcal/mol）、SYK（ΔG=-7.9 kcal/mol）、RTP4（ΔG=-7.8 kcal/mol）和SNX5（ΔG=-7.7 kcal/mol）。与天然配体阳性对照比较，山奈酚的结合亲和力与天然配体相当，且通过氢键及Pi-阳离子/Pi-Pi相互作用与关键氨基酸残基稳定结合。
**14. 山奈酚在斑马鱼血管损伤模型中挽救受损的血管生成。** 在斑马鱼VRI模型中，160 nM VRI损伤导致节间血管严重破坏和密度降低。高剂量山奈酚处理显著恢复受损的节间血管并提高ISV复合评分，表现出强大的促血管生成能力，低剂量组改善不显著。
**五、讨论与结论**
该研究通过整合多组学数据，提出山奈酚治疗PAD的双轨平行机制：一方面作用于PAD病灶中的高炎症巨噬细胞，独立抑制炎症信号并减轻铁死亡应激；另一方面通过改善缺血微环境最终促进血管修复，这在斑马鱼血管生成实验中得到了验证。该研究成功确定了巨噬细胞极化与铁死亡之间的交互作用（crosstalk）是山奈酚治疗PAD疗效的关键机制。研究还讨论了与现有治疗药物（如抗血小板药、他汀类、西洛他唑）及其他天然黄酮类化合物相比，山奈酚独特的双重调节优势。研究承认体外验证使用小鼠RAW264.7细胞系的局限性，并指出未来需要使用人原代单核细胞衍生巨噬细胞或THP-1细胞，以及哺乳动物后肢缺血模型进一步验证。
研究结论：该研究超越了对山奈酚心血管益处的传统理解，利用全面的多组学框架，提出了双轨平行机制：山奈酚作用于PAD病灶中的高炎症巨噬细胞，独立抑制炎症信号并减轻铁死亡应激，改善的缺血微环境最终通过斑马鱼血管生成实验验证的机制促进血管修复。研究人员成功鉴定出巨噬细胞极化与铁死亡之间的交互作用是山奈酚治疗PAD疗效的关键机制。
