《Frontiers in Plant Science》：Comparative genomics, phylogenomic reconstruction and divergence time analysis of 32 Delphinium species based on complete chloroplast genomes
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翠雀属（Delphinium）以其独特的距花为特征，包含众多高海拔特有物种，具有重要的观赏和药用价值。然而，由于传统DNA标记的可变性有限以及复杂的形态同塑性，该属的属内系统发育关系和进化历史至今仍未得到很好的解析。本研究对3种翠雀属物种的完整叶绿体基因组进行
翠雀属（Delphinium）以其独特的距花为特征，包含众多高海拔特有物种，具有重要的观赏和药用价值。然而，由于传统DNA标记的可变性有限以及复杂的形态同塑性，该属的属内系统发育关系和进化历史至今仍未得到很好的解析。本研究对3种翠雀属物种的完整叶绿体基因组进行了测序，并与29种已公开的翠雀属质体基因组相结合，进行了全面的系统发育基因组学分析和分歧时间估计。翠雀属质体基因组表现出高度保守的四分体结构，基因组大小为153,769–157,339 bp。比较基因组分析检测到2,426个简单重复序列（SSR），尽管在5个位点（ndhA-ndhH、ycf2、trnG-trnfM-rps14、rrn23、trnI）内部或邻近区域检测到狭窄的可变窗口（π > 0.02），但它们的整体序列在物种水平上仍高度保守。鉴于这些位点的整体分歧度适中且取代饱和程度较低，这5个位点适用于更深层级的系统发育研究，而传统DNA条形码和SSC来源的区域在物种水平鉴定方面仍然更为有效。基于全质体基因组的系统发育重建有力地支持了翠雀属的单系性，并解析出6个支持良好的主要分支，在拓扑分辨率上优于串联蛋白质编码基因。此外，分歧时间估计显示，翠雀属冠群起源于始新世早期（约53.23 Ma；95%最高后验密度区间：51.68–54.77 Ma）。第一次主要谱系分歧发生在渐新世（约28.53 Ma），由全球降温驱动，随后在上新世和更新世经历了爆发式分化（例如核心分支在3.47 Ma的快速辐射）。这种近期的快速辐射可能由青藏高原强烈隆升和北半球反复冰期所触发。综上所述，本研究为翠雀属的质体基因组进化和系统发育提供了新见解，为其多样化进程的理解构建了可靠的进化框架，并有助于未来的群体遗传学分析。
翠雀属（Delphinium）是毛茛科（Ranunculaceae）中具有重要系统学意义的属，全球约有300–400种，多样性中心集中于青藏高原及邻近地区。该属以花被片延伸形成的管状或钻形距为形态特征，其特化花部形态被认为是被子植物适应性辐射的关键进化创新。然而，传统研究主要依赖有限的核基因（如ITS）和叶绿体标记（如atpB、rbcL），这些标记在同属近缘种间分辨率不足，常导致拓扑结构不一致或出现多分支。同时，有限的分类型采样和遗传数据也限制了先前分歧时间估计的精度。鉴于叶绿体基因组（cpDNA）具有保守的基因含量、适中的核苷酸替代速率以及单亲遗传等优点，应用叶绿体系统发育基因组学可为解析该属的系统发育关系提供坚实基础。本研究旨在通过新测序的3种翠雀属物种（D. densiflorum、D. albocoeruleum、D. trichophorum，均采集自青海省）与29个已公开的叶绿体基因组相结合，在属内亚分支水平上开展系统发育基因组学和分歧时间分析，以弥补以往属级采样密度不足的缺陷，并为解析晚新生代以来青藏高原隆升和更新世冰期波动对该属快速分化的影响提供时间框架。该研究成果发表在《Frontiers in Plant Science》。
研究人员采用了以下关键技术方法：基于Illumina NovaSeq平台（PE150）对3个新采集物种进行全基因组重测序（样本来源分别为青海省贵德县、玉树市和玛沁县，凭证标本存于青海大学标本馆）；运用GetOrganelle v1.7.5.0进行叶绿体基因组从头组装，Geneious Prime v8.1进行基于参考基因组的注释与人工校正；使用DnaSP v6.0进行滑动窗口分析以计算核苷酸多样性（π），利用MISA鉴定简单重复序列（SSR）；借助IRscope分析反向重复区（IR）的收缩与扩张；采用IQ-TREE v2.1.3和MrBayes v3.2.7分别进行最大似然（ML）和贝叶斯推断（BI）系统发育分析；最后在BEAST v2.5.1中运用严格分子钟模型与二次校准策略估计分歧时间。
3.1 翠雀属叶绿体基因组特征
比较分析显示32个翠雀属叶绿体基因组大小介于153,769 bp（D. pylzowii）至157,339 bp（D. grandiflorum）之间，均呈现典型的四分体结构。大单拷贝区（LSC）长度为84,347–88,090 bp，小单拷贝区（SSC）长度为16,047–17,252 bp，反向重复区（IR）长度为25,977–26,594 bp。各基因组均注释到128–131个基因，GC含量高度一致（38.1%–38.3%），表明该属质体基因组结构具有高度保守性。
3.2 翠雀属叶绿体DNA标记
基于32个基因组的比对（总长162,923 bp）共鉴定出7,681个多态位点（4.71%），其中2,514个为简约信息位点。全基因组范围内平均核苷酸多样性π值为0.00478。滑动窗口分析在trnG-trnfM-rps14、ycf2、ndhA-ndhH、rrn23和trnI五个位点内或邻近区域检测到狭窄的高变异窗口（π > 0.02），但这些位点的全长序列平均π值仅为0.00183，显著低于传统DNA条形码（如matK、rbcL、trnH-psbA，平均π = 0.0043）。因此，这些保守位点适用于较高分类阶元的系统发育研究，而传统条形码和SSC区来源的高变区更适合物种水平的鉴别。
3.3 简单序列重复序列与IR边界分析
在32个质体基因组中共鉴定出2,426个SSR位点，各物种平均75.81个，数量范围从D. grandiflorum的63个到D. beesianum和D. yuanum的87个。其中单核苷酸重复基序最为丰富（70.77%），且高度偏向A/T组成。基于IR/单拷贝区（SC）边界的比较，将31个物种划分为5种边界类型（Type I–V），其中Type I为优势类型，JLA边界在所有类型中最为稳定。
3.4 系统发育分析
基于完整叶绿体基因组的ML和BI树均支持翠雀属为单系群，并一致地将属内谱系划分为6个主要分支（Clade I–VI）。Clade I（仅含D. grandiflorum）和Clade II（仅含D. anthriscifolium）以及Clade III（仅含D. gyalanum）为最早分歧谱系，分支支持率均为最高（BS = 100，PP = 1.00）。Clade IV与Clade V–VI的姐妹群关系，以及Clade V与Clade VI的姐妹关系均得到较高支持，且ML与BI拓扑完全一致，所有32个内部节点均达到最大支持。相比之下，基于串联蛋白编码基因（PCG）构建的树仅支持4个主要分支，节点支持度明显降低（仅46.9%的节点BS ≥ 95），且IQ-TREE与BI分析之间出现拓扑冲突，表明完整质体数据集在解析属内快速辐射事件中具有显著优势。
3.5 分歧时间估计
基于BEAST分析和二次校准时间点，翠雀属冠群起源于始新世早期（约53.23 Ma，95% HPD: 51.68–54.77 Ma）。属内的第一次主要谱系分歧发生在渐新世（约28.53 Ma，95% HPD: 26.40–30.70 Ma），推测与始新世—渐新世过渡期后的全球持续降温和栖息地破碎化驱动的隔离分化有关。上新世—更新世期间发生了更为快速的分化事件，例如D. tenii谱系在3.89 Ma分歧，核心冠群在3.47 Ma快速辐射，大量支内分化集中于更新世，可能与青藏高原快速隆升、地形异质化以及北半球多次冰期振荡所产生的"物种泵"效应密切相关。
讨论部分指出，翠雀属质体基因组结构保守、IR区进化动态活跃，SSR分布格局与毛茛科其他属一致，可为未来群体遗传与谱系地理研究提供标记资源。全质体系统发育树在分辨属内近缘种关系上明显优于PCG数据集，但PCG树中出现的拓扑冲突可能提示存在不完全谱系分选（ILS）或古老杂交事件，未来需整合核基因组数据加以验证。分歧时间估计结果支持翠雀属冠群起源于始新世，早于以往族级分析的估算（~33.30 Ma），这一差异源于更密集的属内采样和更丰富的遗传信息，同时也与全球降温、青藏高原隆升和更新世冰期振荡共同塑造的进化历史相吻合。研究结论为：翠雀属冠群在始新世早期起源，渐新世全球降温促进了主要谱系分歧，上新世—更新世青藏高原快速隆升及北半球冰期循环驱动了核心类群的快速辐射分化，从而形成了现代物种多样性格局。本研究为翠雀属的进化动态和生物地理历史提供了新见解，也为未来群体遗传学分析奠定了重要基础。
