《Cancer Biomarkers》：Identification of a cholesterol metabolism-related signature based on KIF20A and NDC80 for prognostic stratification and immunotherapy prediction in hepatocellular carcinoma
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摘要
背景：肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）的异质性使诊断和治疗复杂化，既往预后模型未能取得令人满意的结果。鉴于胆固醇代谢重编程在肝细胞癌的致病机制中发挥着关键作用，本研究以此为突破口开展。方法：研究人员利用来自TCGA、I
摘要
背景：肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）的异质性使诊断和治疗复杂化，既往预后模型未能取得令人满意的结果。鉴于胆固醇代谢重编程在肝细胞癌的致病机制中发挥着关键作用，本研究以此为突破口开展。方法：研究人员利用来自TCGA、ICGC和GEO的多队列数据，筛选胆固醇代谢相关基因（Cholesterol metabolism-related genes，CMRGs），并基于两个关键基因KIF20A和NDC80构建CMRG来源的预后模型。通过Kaplan-Meier和ROC分析评估预测性能。此外，采用CIBERSORT和ESTIMATE算法表征肿瘤免疫微环境（tumor immune microenvironment，TME）。结果：该双基因标签将患者分为高风险组和低风险组，高风险组患者的生存期较差（HR = 2.71，P < 0.001）。升高的风险评分与富含单核细胞/巨噬细胞的免疫抑制性TME相关。探索性抗PD-1分析提示，较高的风险评分与治疗无应答相关，有待进一步验证。结论：整合列线图在1年、2年和3年预测中分别取得了0.747（95% CI：0.665-0.830）、0.728（95% CI：0.652-0.804）和0.778（95% CI：0.706-0.851）的AUC值。该基于KIF20A/NDC80的模型是肝细胞癌可靠的预后工具；其免疫治疗应用价值仍处于探索阶段，需要前瞻性验证。
论文解读
一、研究背景与目的
肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是全球第六大常见癌症，也是癌症相关死亡的第三大原因。尽管手术（包括肝移植和肝切除术）是HCC患者的主要治疗手段，但仅有5%–15%的患者符合手术条件。对于不适合手术切除或已处于晚期阶段的患者，治疗选择极为有限。此外，HCC的显著异质性导致患者预后差异较大，目前的预后分层仍不尽人意。因此，迫切需要建立更精确的预后评估系统以改善患者的生存结局。
代谢重编程已成为癌症的基本特征之一，胆固醇及其代谢产物作为信号分子可促进肿瘤进展。直接证据表明，胆固醇作为内源性配体可激活雌激素相关受体α，该受体是多种癌症的关键调控因子。此外，胆固醇代谢能够影响免疫系统，从而影响肿瘤的免疫微环境。例如，胆固醇蓄积可触发T细胞耗竭。值得注意的是，HCC患者中胆固醇生物合成增加较为普遍，提示异常的胆固醇代谢与疾病进展密切相关，并可能通过形成抑制性免疫微环境影响患者预后。
近年来，免疫检查点阻断疗法已改变肿瘤治疗格局。一项全球、开放标签的III期试验表明，阿替利珠单抗联合贝伐珠单抗使晚期肝细胞癌患者的预期寿命延长了一倍以上；但遗憾的是，仅约27%的患者实现了客观缓解。肝脏的免疫格局具有独特性，包含许多免疫细胞，其中部分细胞（如库普弗细胞）仅存在于肝脏。这些细胞构成了复杂的免疫微环境，部分导致了HCC免疫治疗疗效的局限性。例如，据报道，HCC招募的调节性T细胞可减弱对抗PD-1治疗的反应。然而，胆固醇代谢相关基因异常与HCC免疫治疗反应不佳之间的关联仍知之甚少。
尽管既往研究（如Tang等，2022）已鉴定出肝细胞癌中与胆固醇代谢相关的基因标签，但这些模型往往依赖大量基因，限制了其临床适用性，且缺乏对代谢与细胞周期调控之间相互作用的深入机制探索。为克服上述局限性并填补这一知识空白，本研究系统整合了来自TCGA、GTEx、ICGC和GEO数据库的多队列转录组和临床数据。主要目标是基于两个关键的胆固醇代谢相关基因——KIF20A和NDC80，构建一个稳健且简洁的预后模型，从而提供更具临床转化价值的工具。除传统的风险评分外，研究人员还专门探讨了代谢重编程与细胞周期失调之间的机制耦联（称为"代谢-增殖"轴）。
二、研究队列与方法概述
研究人员利用TCGA-LIHC队列（297例具有完整生存信息和临床注释的HCC样本）作为主要数据来源，随机分为训练集（n = 208）和内部验证集（n = 89）。整合GTEx转录组数据作为正常组织对照。外部验证采用两个独立队列：ICGC队列（n = 204）和GEO队列（GSE14520，n = 445）。通过CPTAC数据库验证候选基因的蛋白质组学表达水平。基因筛选流程包括：以"Cholesterol metabolism"为关键词检索GeneCards数据库（相关性评分> 5.0），通过limma包鉴定差异表达基因（调整后p值< 0.05且|log2FoldChange| ≥ 1.00），并与OS、DSS、PFS相关基因及肿瘤-癌旁/肿瘤-正常组织鉴别基因取交集，最终获得8个关键CMRGs。采用LASSO回归筛选预后特征并构建风险评分模型。免疫浸润分析采用CIBERSORT和ESTIMATE算法。利用GSE215011数据集（10例接受Nivolumab治疗的HCC患者）进行抗PD-1治疗反应的探索性分析。此外，整合单细胞RNA测序数据和空间转录组学数据表征TME。体外实验采用人正常肝细胞系L-02、HCC细胞系HepG2和B细胞来源的Raji细胞系，通过游离胆固醇测定、CCK-8增殖实验、Transwell侵袭实验和蛋白质印迹法验证基因功能。
三、主要研究结果
（一）HCC中差异表达CMRGs的鉴定及其基因组改变图谱
通过系统交集分析，候选基因池最终缩小至8个关键的胆固醇代谢相关基因。这些基因在肿瘤组织中（T-N和T-P比较中）同时上调，并与OS、DSS和PFS的不良预后显著相关。TCGA-LIHC和GTEx数据分析显示表达倍数变化呈强正相关（r = 0.728，p < 0.001），证实KIF20A、NDC80和MEP1A等候选基因持续异常表达。8个差异表达基因主要为点突变，突变频率约为2%–5%。KIF20A易与其他基因发生共突变。临床特征分析显示，这8个差异表达基因与肝纤维化Ishak评分类别及血管侵犯过程显著相关。DSS生存分析显示，基因突变与未突变人群在2.5–5年间的差异最为显著。校正后，HJURP基因在OS和DSS组中的HR大于1，提示其为肝细胞癌的危险因素。
（二）CMRGs与系统代谢而非肿瘤起始的因果关系
孟德尔随机化（Mendelian randomization，MR）分析未观察到所鉴定的CMRGs与肝癌或其他肝脏病理风险之间存在显著的因果关系，提示这些基因作为肿瘤进展的调控因子而非肿瘤发生的启动因子。相反，这些基因与系统代谢特征之间建立了显著的因果关联。CMRGs的遗传变异与基础代谢率和瘦体重密切相关。这些数据表明，CMRGs可能通过重塑代谢格局和身体成分影响患者预后，从而促进肿瘤进展而非启动恶性转化。
（三）预后模型的构建与多队列验证
基于8个差异表达CMRGs，通过LASSO回归分析最终筛选出2个基因KIF20A和NDC80，构建最优预测模型。风险评分 = （0.02655 × KIF20A表达量）+ （0.01291 × NDC80表达量）。根据中位风险评分将TCGA-LIHC队列患者分为高风险组和低风险组。Kaplan-Meier分析证实，在训练集（p < 0.001）和内部验证集（p = 0.016）中，高风险组的OS显著较差。在ICGC外部验证队列中，高风险组生存结局显著较差（HR = 3.28，p = 0.002）；GEO队列中同样如此（HR = 1.55，p = 0.045）。时间依赖性ROC分析显示，TCGA训练集和验证集在1至5年随访期间的AUC值约0.70；ICGC队列1至4年生存预测的AUC超过0.70；GEO队列的AUC范围为0.60至0.65。
（四）HCC中CMRGs的蛋白质组学表达验证及功能分析
CPTAC数据分析显示，HCC患者中KIF20A和NDC80的表达水平显著高于正常组。CCK-8实验表明HepG2细胞呈现过度增殖状态；经Paprotrain（KIF20A特异性抑制剂）处理或加入B细胞上清液后，增殖能力显著降低（P < 0.0001）。游离胆固醇测定显示，HepG2细胞维持显著较高的细胞内胆固醇浓度；抑制KIF20A/NDC80或通过免疫B细胞上清液调节可显著降低游离胆固醇水平。Transwell实验显示，抑制剂处理组的HepG2细胞侵袭能力显著减弱。蛋白质印迹分析显示，KIF20A、NDC80及胆固醇合成和储存的限速酶HMGCR和SOAT1在肝细胞癌细胞中显著升高，但在Paprotrain或免疫B细胞上清液处理后显著下调。上述结果表明KIF20A/NDC80表达与HCC细胞胆固醇代谢之间存在功能联系。
（五）肿瘤免疫微环境（TME）特征及空间异质性分析
高风险组中单核细胞、巨噬细胞、CD8+ T细胞等免疫细胞的浸润显著高于低风险组。高风险组的基质评分和ESTIMATE评分显著较低，而肿瘤纯度评分显著较高，提示高风险肿瘤具有更致密的肿瘤细胞群体和相对耗竭的基质成分。在免疫治疗方面，Nivolumab队列中无应答者的风险评分（Hedges' g = 1.84，p = 0.04）及NDC80（Hedges' g = 1.62，p = 0.05）和KIF20A（Hedges' g = 1.72，p = 0.04）的表达均升高，提示较高的风险评分与抗PD-1治疗无应答之间存在潜在关联。空间转录组和单细胞分析显示，生发中心暗区B细胞（GC B-DZ）在单细胞中呈现最高的相对表达。共现分析揭示了肿瘤细胞与特定免疫亚群（如抗原呈递树突状细胞aDC和巨噬细胞）之间存在显著的空间相互作用。
（六）TCGA-LIHC队列中复合临床-组学列线图的构建与评估
研究人员通过单因素和多因素Cox回归，将年龄、性别、种族、临床分期、TNM分期和风险评分整合为列线图模型，用于预测HCC患者的生存概率。基于列线图衍生风险分层（"MultiRisk"）的Kaplan-Meier分析显示，高风险组的OS显著低于低风险组（HR = 2.71，95% CI：1.76–4.16，p < 0.001）。时间依赖性ROC分析表明，"Multi"模型在1年、2年和3年生存预测中分别取得了0.747（95% CI：0.665-0.830）、0.728（95% CI：0.652-0.804）和0.778（95% CI：0.706-0.851）的AUC值。校准曲线表明模型预测生存概率具有较高准确性。决策曲线分析（DCA）显示多模型是优于传统临床分期的预后指标。
四、讨论与结论总结
讨论部分指出，尽管近年来HCC治疗策略取得了显著进展，但总体5年生存率仍低于12.5%，主要原因是大多数患者在诊断时已处于晚期。KIF20A作为驱动蛋白家族成员，在细胞周期G2期在核内积累并促进病理性肝细胞增殖。甲羟戊酸途径作为胆固醇生物合成的上游分支，是细胞内非甾醇类异戊二烯类物质（FPP和GGPP）的唯一来源，这些脂质部分对于小GTP酶（尤其是RhoA）的异戊二烯化修饰不可或缺。KIF20A通过转运Plk1激活膜结合的RhoA。NDC80作为NDC80复合物的核心成分，在确保有丝分裂期间染色体正确分离中发挥重要作用，其与胆固醇代谢的关联可能归因于富含胆固醇的脂筏对动粒-微管锚定和信号转导的支持。TME分析表明，脂质代谢重编程不仅直接影响HCC细胞，还可能通过调节免疫细胞浸润间接塑造肿瘤进展。免疫检查点抑制剂（ICIs）已成为晚期HCC患者的一线治疗选择，探索性抗PD-1队列分析提示KIF20A/NDC80表达水平与免疫治疗反应之间存在潜在联系。
研究结论强调了一个关键的"代谢-增殖"轴：KIF20A和NDC80的过表达可能作为肿瘤扩张和膜形成所需胆固醇生物合成升高的潜在标志物。整合列线图在TCGA队列中展示了良好的预测准确度和临床净收益，尽管其在外部验证队列中的表现中等，需进一步优化。此外，与风险评分相关的独特免疫景观（特别是单个核细胞浸润）可能为识别免疫检查点阻断的候选者提供探索性线索。研究局限性包括：缺乏KIF20A和NDC80对胆固醇代谢功能依赖的直接实验证据；免疫治疗反应预测结果仍属探索性；模型性能需要在大型多中心前瞻性队列中与现有HCC预后标签进行严格基准比较，以确认其临床转化价值。
