MAP17协调SGLT2依赖性糖酵解重编程驱动训练免疫并加速动脉粥样硬化

《Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology》：MAP17 Orchestrates SGLT2-Dependent Glycolytic Reprogramming to Drive Trained Immunity and Accelerate Atherosclerosis

　　

背景：动脉粥样硬化由代谢-免疫串扰驱动，其中训练免疫维持血管炎症。MAP17（膜相关蛋白17）是一种调节氧化还原和代谢的衔接蛋白，作为SGLT2（钠-葡萄糖共转运体2）的潜在上游驱动因子。研究人员旨在确定MAP17是否将高血糖与动脉粥样硬化中的糖酵解激活、炎症极化和斑块进展联系起来。
方法：分析了30例动脉粥样硬化患者血清中MAP17的表达及其与临床危险因素的相关性。通过持续高葡萄糖和IFN-γ（干扰素-γ）/脂多糖刺激，在骨髓来源巨噬细胞中建立了训练免疫模型。在MAP17过表达/敲低、SGLT2沉默或糖酵解抑制后进行功能测定。
结果：动脉粥样硬化患者中MAP17显著共上调，在伴有糖尿病或代谢综合征的患者中水平最高，并与促炎性M1样细胞因子升高密切相关。颈动脉斑块免疫组织化学证实其与SGLT2在CD68+巨噬细胞丰富、脂质负载和炎症区域共定位。在骨髓来源巨噬细胞中，高葡萄糖强烈诱导MAP17表达，单向上调SGLT2，增强糖酵解通量，增加乳酸产生，并促进M1样极化和泡沫细胞形成。MAP17敲低显著抑制了SGLT2表达、糖酵解以及TNF-α（肿瘤坏死因子-α）/IL（白细胞介素）-1β分泌，而MAP17过表达即使在SGLT2缺陷细胞中也能恢复糖酵解活性、促炎表型和泡沫细胞生成。在糖尿病嵌合Apoe^-/-小鼠中，MAP17激活与糖酵解标志物表达增加、促炎性M1样巨噬细胞比例升高、血管炎症加重及斑块负荷增大相关；这些效应可通过MAP17或SGLT2沉默或糖酵解抑制得到缓解。
结论：MAP17是SGLT2-糖酵解轴的关键上游控制器，促进训练免疫并加速动脉粥样硬化。靶向MAP17可能破坏代谢-炎症反馈环路，代表糖尿病动脉粥样硬化的一种有前景的治疗策略。
临床意义是什么？
本研究确定MAP17（膜相关蛋白17）是巨噬细胞中SGLT2（钠-葡萄糖共转运体2）-糖酵解轴的一个先前未被识别的上游调节因子，将高血糖驱动的训练免疫与加速的动脉粥样硬化联系起来。这些发现通过强调一种可能导致持续性血管炎症和斑块进展的免疫代谢途径，将目前对糖尿病动脉粥样硬化的理解扩展到传统的以脂质为中心的机制之外。临床上，MAP17可能作为识别代谢高危动脉粥样硬化患者（特别是糖尿病或代谢综合征患者）的潜在生物标志物。此外，由于MAP17作用于SGLT2上游并促进促动脉粥样硬化性炎症编程，靶向MAP17可能代表一种补充现有代谢和心血管干预措施的新型治疗策略。尽管还需要在更大规模临床队列和转化研究中进一步验证，但这些发现为完善风险分层和开发基于机制的糖尿病动脉粥样硬化疗法提供了理论依据。

动脉粥样硬化是一种慢性炎症性血管疾病，也是全球心脑血管疾病发病和死亡的主要原因。其特点是持续性血管炎症、脂质沉积和适应不良的组织重塑。这一过程的核心驱动因素是代谢紊乱与免疫激活之间的动态串扰。虽然先天性和适应性免疫细胞均有贡献，但巨噬细胞尤为重要，因为它们在斑块中含量丰富，并且能够整合代谢信号与炎症反应。

近期进展揭示，巨噬细胞可以获得训练免疫，这是一种在短暂暴露于微生物或代谢刺激后建立的记忆样促炎表型，持续数周至数月，并使细胞对后续刺激产生增强反应。这一现象以代谢和表观遗传重编程为基础，使得即使在缺乏持续刺激的情况下也能维持细胞因子的产生、氧化应激和组织损伤。值得注意的是，训练过的巨噬细胞经常表现出氧化还原代谢的重新布线，线粒体和NADPH氧化酶衍生的活性氧（ROS）产生增强。除了直接的氧化损伤外，这些ROS还作为强效信号分子，放大促炎基因表达、稳定缺氧诱导因子，并在动脉粥样硬化病灶内维持炎症-代谢环路。

在可能将代谢重连与训练免疫联系起来的上游调节因子中，MAP17（膜相关蛋白17）已成为一个有趣但研究不足的候选分子。MAP17是一种小型17-kDa非糖基化跨膜蛋白，在正常组织中表达极低，但在多种人类恶性肿瘤中显著过表达。功能上，MAP17扰乱细胞氧化还原稳态，导致持续的ROS积累，既损伤细胞成分又激活信号级联反应，如PI3K/AKT，促进PTEN氧化，抑制凋亡，驱动增殖。

除了肿瘤背景外，MAP17在肾脏葡萄糖处理中至关重要。在近端小管中，它是SGLT2（钠-葡萄糖共转运体2）的必要激活因子，可在不影响表面表达的情况下将转运活性提高达2个数量级。遗传证据强调了这一作用：一名缺乏SGLT2突变的家族性肾性糖尿患者被发现携带MAP17（PDZK1IP1）基因的纯合剪接位点突变。MAP17还与PDZ结构域支架蛋白相互作用，包括PDZK1、NHE3（钠-氢交换体3）和NHERF家族成员，影响转运体的定位、信号传导和内吞运输。近期冷冻电镜研究解析了人SGLT2-MAP17复合物，揭示MAP17结合SGLT2的跨膜螺旋13，并稳定钠偶联葡萄糖同向转运和抑制剂结合所必需的构象。

鉴于增强的糖酵解和脂质代谢失调是动脉粥样硬化形成中公认的标志，MAP17的代谢功能为血管疾病提供了合理的机制联系。ROS产生增加和糖酵解偏向（MAP17上调的标志性后果）已知可触发内皮激活、促进单核细胞募集，并使巨噬细胞向促炎表型极化，从而加速斑块生长和失稳。然而，MAP17在训练免疫和动脉粥样硬化进展中的作用仍 largely 未明确。研究人员因此假设MAP17是动脉粥样硬化的关键调节因子。本研究旨在明确MAP17在巨噬细胞免疫代谢重编程中的作用，并确定其氧化还原和代谢效应如何在高血糖-炎症条件下促进动脉粥样硬化进展。

材料与方法
数据可用性声明
支持本研究结果的数据可应通讯作者要求提供。
人类伦理与知情同意声明
本研究经海军军医大学第二附属医院人类伦理委员会批准（伦理批准号：P2022015）。所有涉及人类参与者的研究程序均符合机构和国家级研究委员会的伦理标准，以及1964年《赫尔辛基宣言》及其后续修正案或类似的伦理标准。所有纳入研究的个体参与者均签署了知情同意书。
伦理声明
本研究经海军军医大学第二附属医院动物伦理委员会批准（伦理批准号：DL20220426）。
主要试剂与抗体
本研究使用的主要试剂和抗体如下：DMEM（11965092，Thermo Fisher Scientific）、重组小鼠IFN-γ（干扰素-γ；485-MI-100，R&D Systems）和IL（白细胞介素）-4（404-ML-010，R&D Systems）、脂多糖（L8880-10MG，Solarbio）、二氯乙酸（347795-25G，Sigma-Aldrich）、MAP17 shRNA/oeRNA和SGLT2 shRNA慢病毒（广州云洲生物）、TRIzol试剂（15596026，Invitrogen）、cDNA转录试剂盒（K1622，Thermo Fisher Scientific）、放射免疫沉淀分析裂解缓冲液（89900，Thermo Fisher Scientific）、抗-SGLT2（ab306558，Abcam）、抗-MAP17（ab199540，Abcam）、抗-β-肌动蛋白一抗（ab8227，Abcam）、HRP（辣根过氧化物酶）偶联二抗（7074S，Cell Signaling Technology）、增强化学发光检测试剂盒（34580，Thermo Fisher Scientific）、细胞计数试剂盒-8（CK04-05，Dojindo Molecular Technologies）、二甲基亚砜（D8418，Sigma-Aldrich）、XFp实时ATP速率检测试剂盒（Agilent Seahorse Bioscience）、异硫氰酸荧光素标记的抗-F4/80（F4/80-FITC；ab60343，Abcam）、藻红蛋白标记的抗-iNOS（诱导型一氧化氮合酶-PE；ab310895，Abcam）、别藻蓝蛋白偶联的抗-CD206（分化簇206-APC；ab270647，Abcam）抗体、ELISA试剂盒（广州泛科生物）、PKH67荧光细胞连接试剂盒（HR8659，Biorebo）、Dil-乙酰化LDL（低密度脂蛋白；L35354，Thermo Fisher Scientific）、苏木精和伊红染色试剂盒（G1120，Solarbio）、油红O（ORO）染色试剂盒（G1261，Solarbio）和Masson三色染色试剂盒（G1346，Solarbio）。
临床样本采集
2022年3月至2023年3月，收集了在我院接受颈动脉内膜剥脱术的30例动脉粥样硬化患者的动脉粥样硬化斑块标本。系统记录了所有动脉粥样硬化患者的一般临床数据，包括空腹血糖和HbA1c（糖化血红蛋白）。空腹血糖在禁食8小时后使用标准化酶法测定。根据评估疾病严重程度的Gensini评分系统，将患者分为轻中度组（n=19，Gensini评分<80）和重度组（n=11，Gensini评分≥80）。此外，采集了这30例动脉粥样硬化患者和30例性别和年龄匹配的健康对照者的外周血样本。通过定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）和Western blot检测血清SGLT2和MAP17 mRNA及蛋白水平，并通过Pearson相关分析评估MAP17与SGLT2表达的相关性。使用ELISA测定斑块组织中炎症细胞因子TNF-α（肿瘤坏死因子-α）、IFN-γ和IL-4的浓度。通过单变量分析确定影响动脉粥样硬化进展的潜在因素。本研究符合《赫尔辛基宣言》，并经医院伦理委员会批准（批准号：P2022015），所有患者或其家属均签署知情同意书。为确保循环mRNA的稳定性，血清样本在采集后1小时内于4°C离心。使用TRIzol LS试剂在严格无RNase条件下提取总RNA，随后立即逆转录以减少转录本降解。
细胞培养
骨髓（BM）来源巨噬细胞（BMDMs）通过冲洗小鼠股骨和胫骨获得。细胞接种在非组织培养皿中，在含有高葡萄糖DMEM（4.5g/L葡萄糖）、10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素、2mmol/L L-谷氨酰胺和20% L929细胞条件培养基（作为巨噬细胞集落刺激因子来源）的分化培养基中维持。分化7天后，收获贴壁BMDMs并以2×10⁵细胞/mL的密度接种于补充了葡萄糖（终浓度20mmol/L）、10ng/mL IFN-γ、100ng/mL脂多糖和10ng/mL重组小鼠IL-4的完全DMEM中孵育16小时。对照组同时在基础DMEM（5mmol/L葡萄糖）中培养16小时。
BMDM代谢记忆模型建立
将BMDMs按上述方法用5或20mmol/L葡萄糖分化，并培养1、2、4或7天。通过贴壁阳性选择BMDMs，转移到含5mmol/L葡萄糖的完全DMEM中，静置48小时以归一化葡萄糖水平。然后用10ng/mL IFN-γ和100ng/mL脂多糖在培养基中刺激16小时，建立体外代谢记忆模型。
慢病毒载体构建与分组
携带MAP17 shRNA、MAP17过表达构建体、SGLT2 shRNA及相应阴性对照的重组慢病毒载体由长沙丰辉生物商业构建。敲低载体基于pGMLV-hU6-MCS-CMV-ZsGreen1-PGK-Puro-WPRE骨架，而过表达载体使用pLV-CMV-MCS-EF1-mCherry-T2A-Puro系统。病毒滴度范围为1.1×10⁸至2.4×10⁸ TU/mL。本研究中使用的shRNA靶序列如下：MAP17 shRNA靶序列为5’-GCTTTGCATGAACTGGAGAAT-3’（靶向小鼠Pdzk1ip1，NM_021551，Sigma-Aldrich），SGLT2 shRNA靶序列为5’-GCCTATTTCCTGCTGGTCATT-3’（靶向小鼠Slc5a2，NM_133254，Sigma-Aldrich）。对于过表达构建体，将全长小鼠Map17 cDNA（NM_021551）亚克隆到pLV-CMV-MCS-EF1-mCherry-T2A-Puro载体的MCS中；空载体作为阴性对照（NC-oeRNA）。对于体外BMDM转导，根据制造商说明用相应慢病毒载体感染分化后的BMDMs。使用含ZsGreen1荧光报告基因的慢病毒载体监测成功转导，感染后72至96小时通过荧光显微镜评估（图S1；表S1）。慢病毒感染后，用嘌呤霉素（1μg/mL）筛选稳定转导的BMDMs 5天，随后在完全培养基中维持以进行后续实验。通过qRT-PCR和Western blot分析确认慢病毒介导的基因调控效率。MAP17和SGLT2敲低效率通过与NC-shRNA组相比靶基因表达水平降低得以验证（图3A和3B）。此外，通过qRT-PCR和Western blot分析确认了MAP17过表达及其对SGLT2表达的调节作用（图4A和4B）。BMDMs分为对照组、高血糖组、IFN-γ+脂多糖组、IFN-γ+脂多糖+二氯乙酸组（10mmol/L，糖酵解抑制剂）、NC-shRNA组、MAP17 shRNA组、SGLT2 shRNA组、SGLT2 shRNA+NC-过表达载体组和SGLT2 shRNA+MAP17过表达组。稳定慢病毒转导并筛选后，细胞用于后续实验。
qRT-PCR检测
使用TRIzol试剂从细胞和组织中提取总RNA，然后用cDNA逆转录试剂盒逆转录。β-肌动蛋白作为SGLT2和MAP17的内参（表1）。使用标准SYBR-Green RT-PCR试剂盒（A25742，Thermo Fisher Scientific）检测mRNA表达，并采用2^-ΔΔCt方法计算实验组与对照组之间的倍数比关系。
Western blot检测
使用放射免疫沉淀分析裂解缓冲液从组织中提取总蛋白。裂解物在4°C下以12 000 rpm离心15分钟。收集上清液后，使用二喹啉甲酸检测试剂盒（23225，Thermo Fisher Scientific）测定蛋白浓度。然后通过丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白并转移到聚偏二氟乙烯膜上。用5%脱脂牛奶（1706404，Bio-Rad Laboratories）封闭后，与抗MAP17、抗SGLT2和抗β-肌动蛋白一抗在4°C孵育过夜，然后与HRP偶联二抗孵育。最后，使用增强化学发光检测试剂盒和图像分析仪ImageQuant LAS 4000（GE Healthcare，阿宾登，英国）对免疫反应蛋白进行可视化检测。使用ImageJ（V1.8.0.112，美国国立卫生研究院）分析图像灰度值。
免疫共沉淀
按照标准程序培养和处理细胞。收集后裂解细胞，提取总蛋白并使用二喹啉甲酸检测试剂盒定量。按照免疫共沉淀试剂盒（88803，Thermo Fisher Scientific）说明进行操作，使用靶标特异性一抗免疫沉淀总蛋白提取物。免疫复合物经电泳和转膜后，用相应的二抗（抗-SGLT2、抗-MAP17）进行免疫印迹以检测结合。
细胞活力检测
细胞以1×10³细胞/孔的密度接种在96孔板中。培养72小时后，向每孔加入10μL细胞计数试剂盒-8试剂（5mg/mL）并孵育4小时。弃去上清液后，加入100μL二甲基亚砜。在590nm波长处测量光密度。计算细胞存活率。
实时ATP代谢分析
使用Seahorse XFe 96实时ATP速率检测试剂盒对BMDMs（8×10⁴细胞/孔；每个生物学样本5个重复）进行细胞外通量分析（根据制造商说明）。注入不同浓度的葡萄糖或对照培养基。7次测量后，依次注入XFp实时ATP速率检测试剂盒中的寡霉素、2-脱氧葡萄糖、FCCP、抗霉素A和鱼藤酮进行后续测量。使用Wave Desktop软件（Agilent 2.6版）自动计算糖酵解ATP（glycoATP）产生速率和线粒体ATP产生速率。
巨噬细胞极化检测
收集贴壁细胞并离心（300×g–400×g，5分钟）。弃去上清液后，将细胞重悬于染色缓冲液中洗涤2至3次。随后，与抗体封闭剂（抗-CD16/32抗体）孵育10至15分钟以封闭非特异性结合。之后将细胞分组进行M1样和M2样标志物检测。加入M1样标志物抗体（F4/80-FITC、iNOS-PE）和M2样标志物抗体（F4/80-FITC、CD206-PE），轻轻混合细胞-抗体混合物，在冰上避光孵育30至60分钟。孵育后用染色缓冲液洗涤细胞2至3次以去除未结合抗体，离心并弃去上清液。然后将样本上样至流式细胞仪（BD FACSCalibur，Becton, Dickinson and Company），使用FlowJo软件（FlowJo v10，Becton, Dickinson and Company）分析数据。最后，通过设置适当门计算F4/80+/iNOS+（M1样巨噬细胞）和F4/80+/CD206+（M2样巨噬细胞）的比例。
炎症因子定量
使用ELISA检测促炎性M1样细胞因子TNF-α（F0121）、IL-1β（F2040）、IL-6（F2163）、IL-12（F30084）和IL-23（F2018），以及抗炎性M2样介质IL-10（F2176）和TGF-β（转化生长因子-β；F2686）。操作严格按照试剂盒说明进行。简要而言，将待测样本和对照加入抗原预包被的微孔板中，依次进行初次洗涤以去除未结合物质、加入检测抗体、二次洗涤、加入底物溶液显色以及加入终止液终止反应。最后在450nm处测量光密度。整个实验约需1.5至2小时完成。
静态粘附实验
将小鼠原代真皮内皮细胞在12孔板中的玻璃盖玻片上培养至融合。用10ng/mL TNF-α（T0157，Sigma-Aldrich）激活单层细胞16小时。此外，使用PKH67荧光细胞连接试剂盒按制造商说明对各组BMDMs进行绿色荧光标记。然后将标记的BMDMs以5×10⁴细胞/盖玻片的密度加入TNF-α激活的内皮单层细胞中共培养1小时。之后用PBS（P5493，Sigma-Aldrich）洗涤去除培养基和非粘附细胞，粘附复合物用4%多聚甲醛固定。最后，从每个盖玻片采集4张图像，计数并平均粘附的荧光标记细胞数。所有展示图像均使用ImageJ软件（版本1.8.0.112，美国国立卫生研究院）统一调整亮度。
巨噬细胞泡沫细胞形成的定量评估
巨噬细胞与25μg/mL浓度的Dil-乙酰化LDL孵育48小时。去除培养基和残余Dil-乙酰化LDL后，用PBS洗涤细胞3次并用4%多聚甲醛固定。随后用ORO染色脂滴，DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚；D9542，Sigma-Aldrich）复染细胞核。采集ORO染色的相差图像和细胞核的荧光图像（每个盖玻片4张），使用ImageJ软件定量脂质含量和细胞计数。然后将脂质面积归一化到每张相应图像中的细胞数，结果以实验组相对于对照组的倍数变化表示。展示图像的亮度进行了统一调整。
动物建模与分组
60只C57BL/6J背景的载脂蛋白E敲除（Apoe^-/-）雄性小鼠（18–20g）购自上海凯学生物。适当时使用年龄匹配的雄性无特定病原体级C57BL/6J小鼠作为对照。所有小鼠均饲养在无特定病原体动物设施中，环境条件受控（温度：22±2°C；相对湿度：55±5%；12小时光照/黑暗循环），可自由获取食物和水。每笼饲养4至5只小鼠，并提供标准环境丰富化。适应期喂食标准实验室饲料（MD17122），主要由玉米粉、小麦粉、麸皮、豆粕、大豆油、鱼粉、鸡肉粉和维生素矿物质预混料组成。对于动脉粥样硬化建模，小鼠改用致动脉粥样硬化性高脂/高胆固醇饮食（D12108C，Research Diets, Inc，美国；等效国内饲料代码：JKHFHC008），含20%蛋白质、40%碳水化合物、40%脂肪和1.25%胆固醇。动物建模：所有用于动脉粥样硬化和骨髓移植模型的小鼠均为雄性。该方法旨在最小化内源性雌激素对血管炎症和脂质代谢的混杂影响。从供体小鼠收集骨髓，并在移植前按照制造商说明用携带MAP17 shRNA、SGLT2 shRNA、MAP17过表达构建体或相应阴性对照的慢病毒载体进行离体转导。移植前，通过GFP（绿色荧光蛋白）/ZsGreen荧光显微镜监测骨髓细胞成功慢病毒转导，具有可检测荧光信号的细胞用于后续移植（图S1）。考虑到原代造血细胞对抗生素筛选的耐受性有限，移植前对骨髓细胞未进行嘌呤霉素筛选，以避免影响细胞活力和植入能力。随后，将5×10⁶个活骨髓细胞静脉注射到致死照射的受体Apoe^-/-小鼠（2×500 rads）中。移植后，所有受体小鼠均置于高脂饮食12周进行动脉粥样硬化建模，未处理的Apoe^-/-小鼠作为对照。分组如下：Apoe^-/-（n=6）、对照供体（n=6）、糖尿病供体（n=12）、二氯乙酸（n=6）、NC-shRNA（n=6）、MAP17 shRNA（n=6）、SGLT2 shRNA（n=6）、SGLT2 shRNA+NC-oeRNA（n=6）和SGLT2 shRNA+MAP17-oeRNA（n=6）。动物实验经我院机构动物护理和使用委员会批准（批准号：DL20220426），并按照相关动物福利法规进行。
终点样本采集与模型验证
12周时，用过量麻醉剂（50mg/mL戊巴比妥钠）处死小鼠，采集全血。分析血清中的甘油三酯、非酯化脂肪酸、LDL-C（低密度脂蛋白胆固醇）和HDL-C（高密度脂蛋白胆固醇）水平。通过qRT-PCR和Western blot测定血清中SGLT2和MAP17的表达。小鼠用PBS灌注，然后用4%多聚甲醛过夜固定。随后分离主动脉并置于70%乙醇中处理。对于血清mRNA检测，血样在采集后1小时内于4°C以4000 rpm离心10分钟。使用TRIzol LS试剂（Invitrogen）在严格无RNase条件下从血清中提取总RNA以减少降解，随后立即逆转录。样本保存在-80°C并避免反复冻融。
糖酵解、炎症和粘附分析
使用乳酸检测试剂盒（MAK064，Sigma-Aldrich）按制造商说明测定乳酸浓度。使用葡萄糖检测试剂盒（GAGO20，Sigma-Aldrich）按制造商说明测定葡萄糖浓度。使用酶活性检测试剂盒（Sigma-Aldrich）定量关键糖酵解酶HK（己糖激酶；MAK091）、PFK（磷酸果糖激酶；MAK093）和PK（丙酮酸激酶；MAK072）的活性。使用ELISA评估炎症细胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12、IL-23、IL-10和TGF-β）的表达，以及粘附分子MCP-1（单核细胞趋化蛋白-1）、ICAM-1（细胞间粘附分子-1）和VCAM-1（血管细胞粘附分子-1）的血清水平。
苏木精和伊红染色
将主动脉根部组织切成10μm切片，用4%多聚甲醛固定30分钟，PBS洗涤3次，每次5分钟。然后用苏木精染色4分钟，PBS洗涤3次，每次5分钟，在显微镜（CX23，Olympus）下观察以评估细胞核染色强度。据此评估，在盐酸-乙醇中分化数秒，分化后立即用自来水冲洗5分钟。然后用伊红复染25秒，经乙醇系列脱水3次，每次5分钟，二甲苯透明3次，每次10分钟，最后用中性树脂封片过夜干燥。根据主动脉根部一致的解剖标志（包括3个主动脉瓣尖的出现）选择代表性切片。随机选择3个视野，在40×放大倍数下观察并拍照记录染色结果。
ORO染色
分离整个主动脉并用4%多聚甲醛固定后，在显微镜下仔细去除外膜周围脂肪组织，用眼科剪刀沿腹侧中线纵向切开主动脉。按A1：A2=3：2的比例配制ORO染液，将展开的主动脉浸入ORO染液中避光15分钟。染色后用60%异丙醇溶液和75%乙醇溶液依次漂洗主动脉，直至整个主动脉呈乳白色。然后将主动脉根部组织切成10μm切片，冷冻切片用4%多聚甲醛固定15分钟，随后进行ORO染色，显微镜下观察并拍照。手动勾画ORO阳性脂质沉积区域进行定量分析，并在代表性图像中标注相应区域。
Masson三色染色
为量化动脉粥样硬化斑块负荷，将多聚甲醛固定的主动脉根部（P6148，Sigma-Aldrich）包埋在最佳切割温度化合物中，并垂直于主动脉瓣平面切片。从3个主动脉瓣尖清晰可见的水平开始，制备厚度为10μm的主动脉根部连续冷冻切片。以50（图5）或80μm（图6和图7）的固定间隔收集连续切片。在所有小鼠中选择具有可比解剖标志（包括3个主动脉瓣尖和主动脉根部最大横截面积）的切片进行分析，以确保各组间解剖位置一致。
qRT-PCR引物序列
MAP17正向引物：ATCGTCTTCGCCGTCAACCT，反向引物：CTGCCATCCATTCCCACC
SGLT2正向引物：ATGGAGCAACACGTAGAGGCT，反向引物：CCACTCAAATCCAGCCACC
β-肌动蛋白正向引物：GCCACAGGACCTCTCATTGAG，反向引物：AGGCGTACAGGGATAGC
DNA甲基化检测
从训练过的巨噬细胞和骨髓祖细胞中提取总DNA。使用亚硫酸氢盐处理然后进行甲基化特异性聚合酶链反应或亚硫酸氢盐测序聚合酶链反应，对促炎（TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12和IL-23）和抗炎（IL-10和TGF-β）基因启动子进行靶向DNA甲基化分析，以评估与训练免疫相关的表观遗传印记。
染色质免疫沉淀检测
进行染色质免疫沉淀以评估组蛋白修饰。简言之，细胞用1%甲醛交联并裂解。通过超声处理剪切染色质，并使用抗-H3K4me3、抗-H3K27ac（激活标记）和抗-H3K9me3（抑制标记）抗体进行免疫沉淀。通过qPCR定量靶细胞因子基因启动子处这些修饰的富集。
统计分析
使用SPSS 23（IBM Corporation）分析数据，使用GraphPad Prism 8.0（GraphPad Software, Inc）生成统计图表。分类数据用百分比表示，连续数据用平均值±标准差表示。使用Shapiro-Wilk检验评估连续变量的正态性，使用Levene检验评估方差齐性。对于同时满足正态性和方差齐性假设的数据，两组间比较使用Student t检验，两组以上比较使用单因素方差分析后进行Tukey事后多重比较检验。当违反方差齐性时，酌情应用Welch校正。对于非正态分布数据，使用非参数检验，包括Mann-Whitney U检验或Kruskal-Wallis检验。变量间的相关性使用Pearson相关分析评估。统计学显著性表示为ns（不显著；P>0.05）；*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001和****P<0.0001。

结果
MAP17在动脉粥样硬化中上调并与SGLT2表达正相关
先前研究已提示MAP17及其下游效应分子SGLT2参与动脉粥样硬化的发病机制。为验证这一点，研究人员首先检测了它们在临床动脉粥样硬化样本中的表达。qRT-PCR和Western blot分析显示，动脉粥样硬化患者血清中MAP17显著上调，伴随SGLT2表达同步增加（n=30；图1A至1D）。Pearson相关分析进一步显示MAP17与SGLT2表达水平之间存在强正相关（图1E），提示MAP17可能在转录或功能水平调控SGLT2。这种协同上调表明MAP17可能作为上游激活因子增强SGLT2表达，从而通过协同免疫代谢机制促进动脉粥样硬化进展。
糖尿病史、代谢综合征和微炎症是影响动脉粥样硬化进展的因素
为系统识别影响动脉粥样硬化进展的因素，研究人员使用Gensini评分系统对30例动脉粥样硬化患者按疾病严重程度分层为轻中度组和重度组进行队列分析。新出现的证据表明，微炎症反应是动脉粥样硬化发生的早期事件，其中内皮细胞损伤和功能障碍可触发炎症反应，吸引单核细胞和其他免疫细胞到达损伤部位。这促使研究人员探究炎症反应与疾病进展之间的关系；因此，通过ELISA检测了两组患者斑块组织中炎症因子TNF-α、IFN-γ和IL-4的表达。包含糖尿病史、代谢综合征和炎症生物标志物的单变量logistic回归模型确定糖尿病史、代谢综合征以及高水平的TNF-α、IFN-γ和IL-4是影响动脉粥样硬化进展的因素（表2）。这一炎症特征支持微炎症反应是动脉粥样硬化发生和发展的驱动因素。虽然两组间HbA1c水平相当（可能反映了标准化的长期降糖治疗），但重度动脉粥样硬化组的空腹血糖水平显著更高（P=0.045；表2）。
高血糖诱导的MAP17激活通过SGLT2驱动巨噬细胞糖酵解和训练免疫
临床分析显示，糖尿病合并动脉粥样硬化患者表现出MAP17表达升高，伴随SGLT2水平增加和疾病严重程度加重。为研究这些观察的机制基础，研究人员使用在糖尿病模拟条件（高葡萄糖+IFN-γ+脂多糖）下刺激的BMDMs建立了体外代谢记忆模型。值得注意的是，高葡萄糖暴露显著上调MAP17表达，随后SGLT2表达在mRNA和蛋白水平均增加，同时细胞活力降低。IFN-γ和脂多糖共刺激进一步放大了这些效应（图2A至2C）。这些结果表明MAP17可能作为葡萄糖反应性上游调节因子，启动激活SGLT2并促进巨噬细胞代谢重编程的级联反应。为进一步验证这一假设，研究人员全面评估了BMDMs的细胞生物能量学和免疫功能。代谢分析显示高葡萄糖下向糖酵解的显著转变，表现为细胞外酸化率升高和glycoATP产生增加，同时耗氧率降低和线粒体ATP输出减少。IFN-γ+脂多糖刺激显著增强了这些代谢变化（图2D至2G）。功能上，高葡萄糖联合炎症刺激驱动了巨噬细胞强烈的M1样极化，表现为iNOS和促炎细胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12和IL-23）表达增加，同时CD206表达和抗炎介质（IL-10和TGF-β）水平降低（图2H至2K）。此外，双重刺激下静态粘附能力和脂质摄取显著增加，表明泡沫细胞形成潜力增强（图2L和2M）。总之，这些发现表明高血糖诱导的MAP17上调是SGLT2激活的关键启动因子，促进糖酵解通量、促炎极化和巨噬细胞驱动的动脉粥样硬化形成，从而将代谢记忆与训练免疫联系起来，推动动脉粥样硬化进展。亚硫酸氢盐聚合酶链反应和染色质免疫沉淀-qPCR分析表明，高葡萄糖预处理的巨噬细胞在促炎基因（TNF-α和IL-6）启动子处表现出显著的DNA低甲基化，并增加了激活型组蛋白标记（H3K4me3和H3K27ac）。这些表观遗传印记在来自糖尿病供体的BMDMs中即使在正常血糖分化7天后仍然存在（图S3至S7）。
MAP17沉默抑制巨噬细胞中SGLT2表达和糖酵解-炎症激活
为进一步阐明MAP17作为糖酵解重编程上游调节因子的作用，研究人员研究了在高葡萄糖和IFN-γ+脂多糖刺激下抑制MAP17、SGLT2和糖酵解对BMDMs的影响（图3A和3B）。值得注意的是，MAP17敲低显著抑制了SGLT2表达，而SGLT2敲低对MAP17水平无影响，表明MAP17正向调控SGLT2且无反向反馈的单向调控关系。这一发现将MAP17定位为训练免疫糖酵解-炎症轴中的潜在上游激活因子。代谢分析进一步表明，使用二氯乙酸抑制糖酵解可恢复细胞活力，表现为细胞外酸化率和glycoATP产生减少，耗氧率和线粒体ATP生成增加（图3C）。MAP17或SGLT2沉默也观察到类似的代谢恢复，两者均有效逆转了炎症刺激诱导的糖酵解转变（图3D至3G），表明这两种分子均参与巨噬细胞的糖酵解激活，其中MAP17作为主要启动因子。同时，免疫表型分析显示二氯乙酸、MAP