三维人诱导多能干细胞衍生心脏类器官用于抗纤维化药物筛选

《Circulation Research》：3-Dimensional Human iPSC-Derived Cardiac Organoids for Antifibrotic Drug Screening

　　

心脏纤维化是心力衰竭的病理特征，可加重心肌功能障碍。然而，当前疗法仍有限，主要由于缺少可转化药物发现平台。为此，研究人员开发了基于人诱导多能干细胞衍生心脏类器官（iPSC-COs）的平台以筛选抗纤维化化合物。不同于仅评估成纤维细胞活化的二维（2D）成纤维细胞培养，3D iPSC-COs捕获心肌细胞与心脏成纤维细胞间串扰，并重现心肌纤维化标志特征，包括细胞外基质（ECM）沉积与收缩功能障碍。研究人员以4:1比例共培养iPSC-心肌细胞与iPSC-心脏成纤维细胞生成iPSC-CO模型，其自组织为3D结构并维持稳定收缩性至少40天。为高通量筛选，iPSC-心脏成纤维细胞由ACTA2（alpha-2 smooth muscle actin）-Clover2报告iPSC系分化，实现肌成纤维细胞活化实时可视化；TGF-β（transforming growth factor-β）刺激下Clover2强度显著升高，而TGF-β抑制剂SB431542或肺纤维化药物吡非尼酮显著减弱荧光，证实Clover2可作为抗纤维化药效可靠读出。研究人员试点筛选多种FDA批准心血管药（LCZ696、缬沙坦、美托洛尔、托拉塞米、呋塞米、阿司匹林）及索拉非尼、双氢青蒿素，发现LCZ696、托拉塞米、双氢青蒿素、索拉非尼在iPSC-COs中明显降低TGF-β诱导Clover2强度，且LCZ696效只在3D共培养显现，依赖心肌细胞源ANP/BNP。继以收缩功能、Ca2+处理与活力反向筛选心毒性，LCZ696、托拉塞米、双氢青蒿素无显著毒性，索拉非尼降低收缩性、延长钙瞬变衰减、减活力。因青蒿素类代谢快，研究人员用平台测双氢青蒿素化学修饰衍生物库，PT30（新双氢青蒿素衍生物）EC50 1.9 μM、至20 μM无显著毒，小鼠口服PK显示比亲本更长半衰期、更高血清浓度与AUC。PT30广谱拮抗TGF-β、ET-1、IL-1β、AngII、PDGF-BB诱导Clover2，且在TGF-β预刺激后减ECM沉积、改善收缩速度。体内AngII/PE预防模型与TAC治疗模型口服PT30（20 mg/kg/天）均改善左室射血分数与二尖瓣E/A、减羟脯氨酸与天狼星红胶原面积。RNA-seq显示PT30逆转TGF-β+ET-1上调的ECM组织/胶原形成与心肌病通路，抑MAPK级联、降ERK/JNK磷酸化， proximity ligation assay示PT30削弱MD2-TLR4互作。综上，3D报告iPSC-COs整合高通量抗纤维化筛选、心毒反向筛选与疾病相关促纤维化刺激，PT30需进一步剂量范围、PK优化与慢性毒理，跨遗传背景iPSC系验证可提升平台预测人心脏纤维化疗效效用。

研究背景方面，心脏纤维化是心力衰竭进展的核心病理特征，可加剧心肌收缩与舒张功能障碍，然而现有抗纤维化疗法十分有限，瓶颈在于缺乏可 translational 的药物发现平台；传统二维（2D）心脏成纤维细胞培养仅能评估成纤维细胞活化，无法重现心肌细胞与成纤维细胞间串扰及细胞外基质（ECM）沉积、收缩功能障碍等完整表型。为此，研究人员在《Circulation Research》发表研究，构建基于人诱导多能干细胞衍生心脏类器官（iPSC-COs）的3D平台，用于抗纤维化化合物筛选与心毒性反向评价，并以双氢青蒿素衍生物PT30为例完成从平台验证、苗头化合物优化到体内药效与机制解析的闭环。

主要关键技术方法包括：由51岁与41岁男性来源iPSC经CRISPR/Cas9敲入ACTA2-Clover2报告构建肌成纤维细胞活化实时荧光读出系统；以iPSC-心肌细胞与iPSC-心脏成纤维细胞4:1混合于超低吸附96孔板自组织为维持≥40天稳定搏动的3D类器官；采用高内涵成像定量最大强度投影下Clover2/Hoechst强度；以Live Cell Motion Imaging测收缩速度、钙成像测Ca²⁺衰减、CellTiter-Glo 2.0测活力进行心毒反向筛选；口服PK在小鼠评估C_max、AUC、T_1/2；体内用AngII/苯肾上腺素（PE）预防模型与横主动脉缩窄（TAC）治疗模型（10–14周C57BL/6J雌雄鼠）；机制层用RNA-seq与GSEA、Western blot检ERK/JNK磷酸化、proximity ligation assay（PLA）检MD2-TLR4互作。

研究结果如下。图A建立iPSC-CO模型：4:1共培养自组织为含cTNT⁺心肌细胞与PDGFRα⁺成纤维细胞中心无坏死结构，TGF-β升Clover2、SB431542与吡非尼酮抑低，证Clover2为可靠抗纤维化读出。图B为平台验证与反向筛选：B-i高通量筛FDA心血管药加索拉非尼、双氢青蒿素，LCZ696、托拉塞米、双氢青蒿素、索拉非尼在3D降Clover2而2D成纤维细胞仅部分一致，LCZ696效依赖心肌细胞ANP/BNP；B-ii心毒反向筛显示索拉非尼降收缩速度、延钙衰减、减活力，LCZ696/托拉塞米/双氢青蒿素安全；B-iii剂量反应得PT30 EC₅₀ 1.9 μM、20 μM无毒；B-iv小鼠PK示PT30较青蒿琥酯、双氢青蒿素半衰期长、暴露高。图C示PT30广谱抗多重促纤刺激（TGF-β、ET-1、IL-1β、AngII、PDGF-BB），TGF-β预刺激7天续治14天可降periostin（POSTN）、COL1A1、fibronectin（FN1）并恢复收缩/舒张速度。图D体内两模型：AngII/PE预防与TAC已建障碍后治疗，口服PT30 20 mg/kg/天均升左室射血分数（LVEF）与二尖瓣E/A、降羟脯氨酸与天狼星红胶原面积。图E机制：TGF-β+ET-1促纤鸡尾酒（PFC）诱ECM与肥厚程序，PT30逆转ECM组织/胶原形成与心肌病通路，抑MAPK级联、降p-ERK/p-JNK，PLA示PT30断MD2-TLR4互作，承接既往青蒿素类靶点为MD2-TLR4之下游。

讨论与结论部分指出，3D报告iPSC-COs提供人相关平台，整合高通量抗纤维化筛选、心毒反向筛选与疾病相关促纤刺激，克服2D局限并捕捉细胞间串扰。PT30作为双氢青蒿素衍生化合物，兼顾强效（EC₅₀ 1.9 μM）、低心毒、优口服PK与体内预防/治疗双效，机制为抑MD2-TLR4互作进而阻MAPK（ERK/JNK）磷酸化。临床转化前PT30仍需剂量范围、PK优化与慢性毒理，且应跨多样遗传背景iPSC系验证以提升对人心脏纤维化疗效预测力。该研究意义在于给出可评价“抗纤维化效力—心毒窗口—PK属性”三位一体的类器官药物发现范式，并为青蒿素类结构优化抗慢性纤维化提供候选分子。