《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》：Biosynthesized chitosan nanoparticles from Krameria lappacea: a strategy to ameliorate coccidiosis-induced intestinal dysfunction
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摘要翻译
背景：球虫病是一种由艾美耳球虫属（Eimeria）寄生虫引起的主要寄生虫病，可导致肠道损伤、氧化应激和营养吸收受损。与常规抗球虫药物相关的耐药株风险及其他不良反应，使得开发更安全的天然替代品成为必要。因此，本研究检测了来源于Krameria lapp
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背景：球虫病是一种由艾美耳球虫属（Eimeria）寄生虫引起的主要寄生虫病，可导致肠道损伤、氧化应激和营养吸收受损。与常规抗球虫药物相关的耐药株风险及其他不良反应，使得开发更安全的天然替代品成为必要。因此，本研究检测了来源于Krameria lappacea根提取物生物合成的壳聚糖纳米颗粒（chitosan nanoparticles，CNPs）对艾美耳球虫（Eimeria papillata）诱导的小鼠球虫病的抗球虫效果。
方法：使用K. lappacea根提取物生物合成壳聚糖纳米颗粒，并通过透射电子显微镜（TEM）、紫外-可见光谱（UV–visible spectroscopy）和傅里叶变换红外光谱（FT-IR）对其进行表征。雄性C57BL/6小鼠实验性感染103个E. papillata孢子化卵囊，并口服给予5、10和20 mg/kg剂量的CNPs，同时使用氨丙啉（amprolium，120 mg/kg）作为参考抗球虫药物。在感染后第5天评估粪便卵囊排出量、体重变化、空肠组织病理学、细胞内寄生虫阶段、氧化应激生物标志物、抗氧化酶活性、葡萄糖和总蛋白含量。
结果：TEM分析显示，合成的CNPs主要呈球形，粒径范围为57.01至83.05 nm，平均直径约为70.16 nm。FT-IR分析表明存在与醇、胺、硫酸盐和卤代化合物相关的官能团。E. papillata感染导致显著的体重减轻、卵囊排出增加、严重的空肠组织病理学改变、一氧化氮（NO）和过氧化氢（H?O?）水平升高，并降低葡萄糖、总蛋白、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）的水平。CNPs治疗在所有治疗组中均显著减少了粪便卵囊排出量；然而，5 mg/kg剂量最为有效，将卵囊排出量降低至1.308 × 10? ± 2.54 × 10? oocysts/g粪便，而感染未治疗组为7.196 × 10? ± 2.77 × 10? oocysts/g粪便。10和20 mg/kg CNPs剂量所实现的降低效果较弱。CNPs给药还显著减少了细胞内寄生虫阶段，改善了空肠组织学结构，恢复了葡萄糖和蛋白质含量，提高了抗氧化能力，并降低了氧化应激。CNPs的治疗效果与参考药物氨丙啉相当或更优。
结论：CNPs对小鼠E. papillata感染表现出有效的抗球虫、抗氧化和保护作用。这些发现表明，CNPs是管理球虫病的一种有前景的天然替代品，值得进一步研究其作用机制、安全性以及在兽医学中的潜在应用。
论文解读文章
球虫病是由艾美耳球虫属（Eimeria）原生动物寄生虫引起的重要寄生性疾病，严重威胁畜禽养殖业，尤其在家禽和牛产业中造成显著的经济损失，并可能影响全球食品安全。Eimeria入侵肠道上皮后，可诱发绒毛萎缩、炎性浸润、氧化应激、腹泻、营养吸收不良及生长性能下降等病理改变。在小鼠模型中，Eimeria papillata感染因生命周期明确且肠道病理可重复，被广泛用于宿主-寄生虫互作研究和新型抗球虫药物评价。传统抗球虫药物如氨丙啉和磺胺类药物的长期使用已导致耐药株出现、动物产品药物残留及潜在宿主组织不良反应等问题，因此开发来源于天然物质的安全有效替代疗法十分迫切。近年来，药用植物作为生物活性化合物的丰富来源受到关注，其中Krameria lappacea的根含有酚类、黄酮类、鞣质和木脂素等活性成分，具有抗菌、抗氧化和抗寄生虫活性。同时，纳米技术的发展为提升天然化合物疗效和生物利用度提供了新途径，壳聚糖纳米颗粒（chitosan nanoparticles，CNPs）因其生物相容性、可降解性、低毒性和抗菌性能在生物医学领域受到广泛关注。然而，关于利用K. lappacea根提取物生物合成CNPs的抗球虫效果，特别是在实验性小鼠球虫病中的疗效，目前信息有限。为此，研究人员设计本研究，以E. papillata诱导的小鼠球虫病为模型，评估K. lappacea根提取物生物合成CNPs的抗球虫潜力及其对寄生虫负荷、肠道组织病理和氧化应激水平的影响。
研究人员将K. lappacea根制备成70%甲醇提取物，与中分子量壳聚糖在酸性条件下混合，通过绿色合成方法生物合成CNPs，并利用透射电子显微镜（TEM）、紫外-可见光谱和傅里叶变换红外光谱（FT-IR）对纳米颗粒进行表征。实验采用雄性C57BL/6小鼠，设置阴性对照、CNPs单独处理、感染未处理阳性对照、感染后分别给予5、10、20 mg/kg CNPs处理以及感染后给予120 mg/kg氨丙啉参考药物处理等7个组，每组5只小鼠。除对照组外，各组小鼠经口接种103个孢子化E. papillata卵囊，接种后60分钟开始每日一次口服相应治疗药物。在感染后第5天，评估粪便卵囊排出量、体重变化、空肠组织病理、细胞内寄生虫发育阶段、氧化应激指标（NO、H?O?）、抗氧化酶（CAT、GPx）活性以及空肠葡萄糖和总蛋白含量。
研究结果显示，TEM分析表明合成的CNPs主要呈球形，粒径范围为57.01至83.05 nm，平均直径约70.16 nm。紫外-可见光谱在260 nm处显示单一吸收峰，确认了纳米颗粒的形成。FT-IR分析显示CNPs存在O-H伸缩振动（3435.50 cm?1）、C=C伸缩振动（1577.20 cm?1）、S=O伸缩振动（1410.00 cm?1）、C-N伸缩振动（1019.08 cm?1）和C-Br伸缩振动（648.49 cm?1），表明存在醇、环烯烃、硫酸盐、胺和卤代化合物等官能团，这些官能团来源于壳聚糖和K. lappacea植物化学组分，有助于纳米颗粒的稳定并增强其生物活性。
在寄生虫负荷方面，感染未治疗组小鼠粪便卵囊排出量约为7.196 × 10? ± 2.77 × 10? oocysts/g粪便，而5 mg/kg CNPs处理后显著降低至1.308 × 10? ± 1.36 × 10? oocysts/g粪便，约减少81%，且效果优于参考药物氨丙啉（1.66 × 10? ± 4.05 × 10? oocysts/g粪便）；10和20 mg/kg剂量的降低效果较弱，表明CNPs的抗球虫效果并非剂量依赖性，低剂量反而更有效，这可能与高浓度下纳米颗粒聚集、胶体稳定性下降以及细胞摄取饱和等因素有关。在体重变化方面，阴性对照组小鼠体重平均增加约4.63%，而感染未治疗组体重下降约4.83%，5 mg/kg CNPs治疗可将体重下降减轻至约-2.69%，表明CNPs改善了感染引起的生理损害。
在肠道组织病理和寄生虫发育阶段方面，组织学检查显示感染组小鼠空肠出现严重病理改变，包括上皮变性、绒毛破坏、炎性浸润以及大量寄生虫发育阶段。CNPs治疗显著减轻了这些病理变化，并明显减少了细胞内寄生虫阶段数量，从感染组的114.96 ± 19.69个/10绒毛-隐窝单位（VCU）降至19.90 ± 3.94个/10 VCU。寄生虫发育阶段包括裂殖体（meronts）、小配子体（microgamonts）、大配子体（macrogamonts）和发育中卵囊均在CNPs治疗后显著减少，表明CNPs能有效抑制寄生虫在肠上皮内的增殖。
在营养吸收相关指标方面，E. papillata感染导致空肠葡萄糖水平从对照组的0.052 ± 0.004 g/dL降至0.022 ± 0.003 g/dL，总蛋白含量从3.07 ± 0.36 g/dL降至0.95 ± 0.32 g/dL。CNPs治疗后，葡萄糖水平显著回升至0.041 ± 0.006 g/dL，总蛋白含量恢复至1.87 ± 0.13 g/dL，表明CNPs有助于恢复肠道吸收功能和代谢稳态。
在氧化应激和抗氧化防御方面，E. papillata感染导致空肠过氧化氢酶（CAT）活性从对照组的13.99 ± 0.66 U/g显著降低至5.63 ± 1.01 U/g，谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）水平从21.05 ± 1.40 mg/g降低至约9.84 ± 0.26 mg/g；而CNPs治疗显著恢复CAT至10.20 ± 0.78 U/g，GPx至16.62 ± 1.75 mg/g，与参考药物氨丙啉效果相当。同时，感染导致一氧化氮（NO）水平从对照组的15.50 ± 0.78 μmol/L显著升高至27.97 ± 1.31 μmol/L，过氧化氢（H?O?）水平从0.31 ± 0.07 mM/g升高至0.76 ± 0.08 mM/g；CNPs治疗显著降低NO至18.12 ± 1.36 μmol/L，H?O?至0.53 ± 0.04 mM/g，表明CNPs具有减轻氧化应激的作用。
讨论部分指出，CNPs的抗球虫效果可能源于直接抗寄生虫作用和保护宿主肠道组织的协同机制。壳聚糖纳米颗粒的正电荷表面可与带负电的寄生虫膜发生静电相互作用，导致膜不稳定并抑制寄生虫发育；同时，K. lappacea根提取物中的酚类、黄酮类和鞣质等植物化学组分作为还原剂和稳定剂包被在纳米颗粒表面，赋予其额外的抗氧化活性。CNPs的治疗效果与氨丙啉相当，在某些指标上甚至更优，这与其多靶点作用模式有关，可能降低耐药性发展的风险。本研究存在一定局限性，如未直接测量肠道吸收功能、样本量较小、仅评估感染后第5天单一时间点，且未探讨分子机制和免疫相关通路。
研究结论部分翻译如下：本研究结果表明，CNPs在实验性E. papillata感染小鼠模型中发挥了有前景的抗球虫、抗氧化和组织保护作用。这些有益效应似乎与抑制寄生虫复制、保护肠道结构、恢复组织葡萄糖和总蛋白浓度（提示肠道功能恢复改善）及减轻感染诱导的氧化应激有关。然而，由于葡萄糖和总蛋白浓度为间接指标，这些发现不应被解释为肠道营养吸收恢复的直接证据。此外，由于这些结果是在实验性小鼠模型中获得的，将其直接转化应用于兽医实践时应谨慎。需要进一步研究，包括肠道黏膜的详细形态计量分析、消化酶活性评估、营养转运蛋白和紧密连接蛋白表达、肠道通透性，以及分子分析、免疫反应调节、药代动力学和毒理学评价，并在实验和现场条件下于目标动物物种中进行验证，以阐明这些保护作用的确切机制并确定其安全性和有效性。总之，本研究为CNPs作为候选抗球虫策略的潜力提供了证据，并为未来开发控制兽医学和家禽生产中球虫病的替代方法奠定了基础。
