《Frontiers in Cardiovascular Medicine》：Perfluorooctanoic acid–associated complement factor B upregulation and atrial fibrillation–related molecular alterations: integrated network toxicology, Mendelian randomization, molecular dynamics, and HL-1 cell analyses
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摘要
背景：全氟辛酸（perfluorooctanoic acid，PFOA）是一种持久性环境污染物，与心血管功能障碍相关，但PFOA暴露与心房颤动（atrial fibrillation，AF）之间的分子联系仍不明确。研究人员旨在优先筛选连接PFOA与AF
摘要
背景：全氟辛酸（perfluorooctanoic acid，PFOA）是一种持久性环境污染物，与心血管功能障碍相关，但PFOA暴露与心房颤动（atrial fibrillation，AF）之间的分子联系仍不明确。研究人员旨在优先筛选连接PFOA与AF的候选中介分子，并检测其在心房心肌细胞中的相关分子效应。
方法：将来自CTD、STITCH和SwissTargetPrediction数据库的PFOA相关或计算预测基因与AF相关基因进行整合。采用探索性孟德尔随机化（Mendelian randomization，MR）、公共单细胞分析、蛋白质相互作用与富集分析、分子对接、单次100 ns分子动力学（molecular dynamics，MD）轨迹及HL-1细胞实验对补体因子B（complement factor B，CFB）进行评估。细胞暴露于25 μM PFOA处理48小时，伴或不伴CFB沉默，随后进行实时定量PCR（qRT-PCR）、蛋白质印迹（Western blotting）、免疫荧光及CCK-8检测。
结果：CFB是整合的PFOA相关靶点集与筛选后的AF相关基因集之间唯一共有的候选分子。遗传预测的血浆CFB水平与AF风险呈正向相关（比值比=1.109，95%置信区间：1.021–1.205；FDR校正P=0.015）。公共单细胞数据显示CFB在心脏成纤维细胞和基质细胞群中呈现优先基础表达，而心肌细胞中表达水平较低。预测的PFOA–CFB结合构象在采样轨迹期间保持在所选口袋内。在HL-1细胞中，PFOA增加了CFB mRNA和蛋白丰度，降低CACNA1C转录本水平但未显著改变CACNA1C蛋白丰度，同时增加KCNJ2和NPPA表达。CFB沉默减弱了PFOA相关KCNJ2和NPPA的增加，而CACNA1C未显示相应的恢复模式。在cTnT阳性、PFOA暴露的HL-1细胞中检测到CFB免疫反应性。
结论：这些发现将CFB确定为可能与PFOA暴露和AF相关分子改变相关的候选分子。但研究并未建立直接的PFOA–CFB结合、功能性补体激活、因果关系、电重构或功能性AF表型。
论文解读：全氟辛酸相关补体因子B上调与心房颤动相关分子改变的综合分析
**一、研究背景与科学问题**
全氟辛酸（perfluorooctanoic acid，PFOA）属于全氟和多氟烷基物质（per- and polyfluoroalkyl substances，PFAS）家族，是一种广泛应用于工业生产和消费品（如不粘涂层、消防泡沫和防水纺织品）的合成化合物。其碳–氟骨架赋予其极强的环境降解和生物代谢抗性，导致其在水体、土壤和生物体中持续存在。人群生物监测研究显示，PFOA在人体血液和组织中蓄积，半衰期超过三年。越来越多的证据将PFOA暴露与多种不良健康结局相关联，包括发育毒性、内分泌干扰、代谢功能障碍和癌症。其中，PFOA的心血管毒性日益受到关注。人群研究报道了血清PFOA水平升高与高血压、卒中和心血管死亡风险增加之间的关联。
心房颤动（atrial fibrillation，AF）是最常见的持续性心脏心律失常，影响全球数百万人。其特征是心房电活动紊乱，导致心律不规则且常为快速节律。AF的发生涉及心房组织的电学和结构重构，可由衰老、高血压、心力衰竭和全身性炎症触发或加剧。炎症和免疫激活在AF的启动和维持中发挥关键作用。然而，补体激活——先天免疫应答的重要分支——在AF病理生理学中的作用仍研究不足。
补体因子B（complement factor B，CFB）是补体激活替代途径的核心组分。与补体片段C3b结合后，CFB被因子D裂解生成C3转化酶（C3bBb），启动强效扩增环，产生下游效应分子如C3a、C5a和膜攻击复合物。该通路的失调与炎症性和心血管疾病相关，但其在AF中的相关性，特别是在环境毒物暴露背景下，尚不明确。基于此，研究人员开展了本项研究，旨在通过网络毒理学、孟德尔随机化、分子动力学模拟和HL-1细胞实验的整合分析，优先筛选并评估CFB作为连接PFOA暴露与AF的候选分子。
**二、主要关键技术方法**
研究人员采用了多层次的整合研究策略。首先，通过网络毒理学分析，从比较毒理基因组学数据库（CTD）、STITCH和SwissTargetPrediction数据库收集PFOA相关或计算预测的候选靶点，并与从GeneCards数据库获取的AF相关基因取交集。其次，利用deCODE血浆蛋白质组GWAS的顺式pQTL数据和FinnGen第12版的AF汇总统计数据进行两样本孟德尔随机化分析。第三，利用人类蛋白质图谱（HPA）数据库进行单细胞表达分布和亚细胞定位分析。第四，采用AutoDock Vina进行分子对接，并使用GROMACS 2022.4执行100 ns分子动力学模拟。第五，使用小鼠心房心肌细胞系HL-1进行体外实验，包括CCK-8细胞活力测定、qRT-PCR、蛋白质印迹和免疫荧光染色。HL-1细胞系购自Sigma-Aldrich，细胞实验涉及25 μM PFOA处理48小时，以及CFB特异性siRNA转染沉默。
**三、主要研究结果**
**3.1 PFOA的网络毒理学分析和孟德尔随机化**
网络毒理学分析显示，ProTox预测PFOA具有中等毒性，预测LD
50为518 mg/kg，毒性类别为4级。CTD数据库疾病富集分析表明PFOA主要与代谢性疾病、心血管疾病和神经系统疾病相关。孟德尔随机化分析显示，在优先筛选的候选分子中，CFB与AF风险呈显著正向关联（OR=1.109，95% CI: 1.021–1.205，FDR校正P=0.015；nsnp=8），异质性分析未显示显著异质性（IVW Q=2.175，P=0.950）。将整合的PFOA相关靶点集与筛选后的81个AF相关基因取交集后，CFB被确定为唯一共有的候选分子。
**3.2 CFB的心脏单细胞分布、亚细胞定位和基因组特征**
HPA心脏单细胞RNA-seq分析显示，CFB表达并未广泛分布于所有心脏细胞类型，而是在成纤维细胞和基质样细胞群中检测到主要信号，而心肌细胞中的表达相对较低。HPA免疫荧光分析显示，在ASC52telo和A-431细胞中，CFB相关信号位于细胞连接处及囊泡/内质网相关区室中。基因组注释显示CFB位于染色体6p21.33的主要组织相容性复合体区域内，UCSC基因组浏览器可视化了多个注释的转录本异构体和外显子–内含子结构。
**3.3 预测的CFB–PFOA复合物的分子动力学行为**
在100 ns模拟轨迹期间，CFB–PFOA系统的RMSD在约15–20 ns后达到表观平台期，且在部分模拟时间内低于参考配体系统。回转半径在采样期间也略低于参考系统。残基水平RMSF图谱在两个系统间总体相当。轨迹期间观察到PFOA与周围残基之间形成反复的氢键接触。预测的PFOA结合构象在整个采样轨迹中保持在所选口袋内，计算的短程静电和范德华相互作用能为负值。然而，由于仅分析了单次100 ns轨迹且未进行正式收敛验证，这些结果仅提供可检验的结构假说而非CFB功能调节的证据。
**3.4 CFB的相互作用网络和通路富集**
BioGRID和STRING两个数据库整合的相互作用组突出了以补体为中心的子网络，包含核心替代途径酶和调节因子——C3、C4A/C4B、CFD（因子D）、CFP（备解素）、CFH、CFI和CFHR1/3，其中CFB作为中心节点。KEGG通路富集分析显示"补体和凝血级联"是最显著富集的通路（校正P<0.05），其次是"金黄色葡萄球菌感染"和"冠状病毒病–COVID-19"。GO富集分析中，生物学过程方面显著富集了体液免疫应答、补体激活（包括替代途径）、吞噬作用及吞噬作用的正向调节；细胞组分方面定位于分泌/血小板颗粒腔、囊泡腔、内质网腔、血液微粒和含胶原蛋白的细胞外基质；分子功能方面富集了补体结合（包括C3b结合）、调理素结合、肽酶调节活性和丝氨酸型内肽酶活性。
**3.5 PFOA暴露、CFB表达及HL-1细胞中AF相关分子标志物**
CCK-8筛选确定25 μM PFOA处理48小时为体外机制研究条件，该条件下细胞活力未显著降低。qRT-PCR显示PFOA增加HL-1细胞中Cfb mRNA表达，而CFB特异性siRNA在有无PFOA条件下均显著降低Cfb表达。PFOA暴露降低了CACNA1C转录本水平，同时增加了Kcnj2和Nppa转录本水平。CFB沉默减弱了PFOA相关的Kcnj2和Nppa变化，而CACNA1C未显示相应的PFOA依赖性恢复模式。各实验组间CCK-8细胞活力无显著差异。
**3.6 HL-1心房心肌细胞中蛋白质水平和免疫荧光分析**
蛋白质印迹分析证实PFOA增加CFB蛋白丰度，CFB沉默在有无PFOA条件下均显著降低CFB蛋白水平。PFOA增加了KCNJ2和NPPA蛋白丰度，而CACNA1C蛋白丰度相对于对照无显著变化。CFB沉默减弱了PFOA相关的KCNJ2和NPPA变化。免疫荧光染色显示，在PFOA暴露的HL-1细胞中，细胞质CFB免疫反应性（绿色）存在于cTnT阳性心肌细胞内，绿色和红色通道重叠处呈黄色。
**四、讨论与结论**
本研究采用整合性、假说生成的框架将CFB优先确定为可能与PFOA暴露和AF相关分子改变相关的候选分子。网络毒理学、探索性MR、分子模拟和HL-1细胞实验提供了互补但不同层面的证据。机制上，CFB表达和活性与多种心血管病理状态相关。既往研究报道补体激活通过募集中性粒细胞和刺激成纤维细胞分化促进心房纤维化；心脏手术模型中术后CFB水平升高与术后AF发生率较高相关。分子对接和动力学模拟为PFOA–CFB潜在相互作用提供了计算结构假说。尽管公共单细胞数据显示正常人心脏中CFB基础表达优先富集于成纤维细胞和基质细胞群，但细胞实验证明HL-1心房心肌细胞在毒物应激条件下可在mRNA和蛋白水平表达CFB。
研究存在以下局限性：单培养模型不能重现成纤维细胞–心肌细胞旁分泌相互作用；CFB表达增加不证明替代补体途径的功能性激活；CACNA1C、Kcnj2和Nppa表达变化代表所选AF相关分子标志物的改变，不建立功能性电重构或AF表型；25 μM PFOA浓度远高于普通人群中的典型循环浓度；MR分析缺乏完整的工具变量强度、水平多效性和留一法敏感性评估；分子动力学仅分析单次100 ns轨迹。
总之，本研究将CFB确定为可能与PFOA暴露和AF相关分子改变相关的候选分子。PFOA增加了HL-1细胞中CFB表达并改变了所选AF相关标志物，而CFB沉默减弱了这些变化。这些探索性发现产生了可检验的假说，但未建立功能性补体激活、直接因果关系或功能性AF表型。
