早发性帕金森病哥伦比亚患者的基因筛查

《Neurology Genetics》：Genetic Screening of Colombian Patients With Early-Onset Parkinson Disease

　　

背景与目标：早发性帕金森病（early-onset Parkinson disease，EOPD）定义为50岁前出现症状，约占患者总数的10%，且被认为比典型晚发型具有更强的遗传成分。PRKN、PINK1和DJ-1基因的隐性变异是EOPD最常见的遗传病因，然而大多数研究针对白人血统患者。本研究旨在分析哥伦比亚患者中PRKN、PINK1和DJ-1的遗传变异，以帮助填补南美人群EOPD遗传研究的空白。方法：研究人员采用桑格测序（Sanger sequencing）对43例无亲缘关系的EOPD患者进行PRKN、PINK1和DJ-1基因分析，并采用多重连接探针扩增技术（multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA）检测拷贝数变异。此外，对3例发病年龄小于30岁且未明确诊断的患者（长读长测序[long-read sequencing，LRS]患者A–C）进行了长读长全基因组测序。结果：研究人员在PRKN基因中鉴定出已知致病的单核苷酸变异和拷贝数变异，解释了2例患者的病因（占患者的4.6%）。在患者1中观察到2个PRKN致病变异（c.155delA；p.N52Mfs*29和c.1083+1G>A），该患者报告的发病年龄为16岁。研究人员进一步在另一名发病年龄为18岁的患者中检测到PRKN外显子5–6的纯合重复。讨论：本研究有助于刻画哥伦比亚EOPD患者的遗传贡献因素，表明遗传型（PRKN、PINK1和DJ-1）较为罕见。研究结果强调，需要将多样化人群纳入研究，以提高对疾病遗传机制的理解。

**论文解读：哥伦比亚早发性帕金森病患者的基因筛查研究**

**一、研究背景与科学问题**

帕金森病（Parkinson disease，PD）是全球范围内导致残疾的主要神经系统疾病之一，其患病率增长速度已超过其他神经系统疾病。按照发病年龄，PD可分为晚发性帕金森病（late-onset PD，LOPD）和早发性帕金森病（early-onset PD，EOPD）。EOPD约占全部PD患者的10%，以50岁前出现运动症状为界定标准，患者中阳性家族史的比例（20%）显著高于LOPD患者（7%），提示EOPD具有更强的遗传易感基础。EOPD相关基因涉及常染色体显性遗传机制（如SNCA三倍化）和隐性遗传机制（如PRKN、PINK1和DJ-1），这些基因的变异形式包括单核苷酸变异（single-nucleotide variant，SNV）、单外显子剂量变异、拷贝数变异（copy number variant，CNV）以及基因组多重化等。然而，绝大多数EOPD遗传学研究聚焦于欧洲裔人群，南美洲等临床遗传研究中代表性不足的人群的遗传构成仍缺乏系统刻画。有限的研究提示，西班牙裔EOPD人群中PRKN变异频率较非西班牙裔白人人群高约2.7倍；一项涵盖71例厄瓜多尔和26例哥伦比亚EOPD病例的研究中，通过多重连接探针扩增技术（multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA）在系列样本中检出PRKN外显子5–6重复及外显子7缺失。鉴于基因变异可能存在人群特异性频率，开展未被充分研究人群的调查，对于阐明PD的病理生理机制和临床异质性具有重要意义。为弥补拉丁美洲PD遗传学数据不足，本研究对43例来自哥伦比亚的无亲缘关系EOPD患者开展PRKN、PINK1和DJ-1基因变异特征分析，并对3例发病年龄小于30岁且初筛未明确的患者进行长读长全基因组测序（long-read sequencing，LRS），以期加深对哥伦比亚人群EOPD遗传起源的理解。该论文发表于《Neurology Genetics》。

**二、主要技术方法**

研究人员从哥伦比亚波哥大运动障碍门诊连续招募200例PD患者，其中43例无亲缘关系患者符合EOPD标准（症状发作年龄<50岁）纳入研究，研究对象主要为梅斯蒂索人后裔并居住于波哥大城市及郊区。采用双向桑格测序对PRKN（NM_004562.3）、PINK1（NM_032409.3）和DJ-1（NM_007262.5）全部编码外显子及侧翼15个碱基对区域进行检测；应用MLPA P051 Parkinson mix 1试剂筛查拷贝数变异（包括SNCA基因组倍增）；对3例初筛阴性的早发患者（发病年龄<30岁）进行PacBio Revio平台长读长全基因组测序，并通过TaqMan拷贝数测定验证PRKN拷贝数变异；此外，运用微卫星标记进行单倍型分析以追溯共享祖先，结合纯合性分析区分纯合重复与杂合三倍化。

**三、研究结果**

**队列特征与靶向基因筛查结果。** 研究队列包含23例男性和20例女性EOPD患者，平均发病年龄41岁（范围16–49岁），数据采集时平均年龄47.2±6.3岁。在43例患者中共检出PRKN变异8个、PINK1变异7个、DJ-1变异1个，未检出SNCA基因组倍增。根据美国医学遗传学与基因组学学会（American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG）和分子病理学协会（Association for Molecular Pathology，AMP）标准，大部分变异为良性，少数为意义不确定变异（variant of uncertain significance，VUS）。

**致病性或可能致病性PRKN变异的鉴定。** 患者1（发病年龄16岁）携带复合杂合致病性PRKN变异：剪接位点SNV（c.1083+1G>A；外显子9+1）可能破坏正常剪接，以及外显子2杂合单碱基缺失（c.155delA；p.N52Mfs*29）导致移码和蛋白质提前截短。MLPA检测发现2例患者携带PRKN外显子5–6的纯合重复或杂合三倍化，对应个体的发病年龄分别为18岁（LRS患者A）和35岁（患者2）。单倍型分析显示LRS患者A与先前报道的哥伦比亚患者共享同一种单倍型；患者2则基于D6S305标记位点的独特等位基因模式（204/204）呈现不同单倍型。

**长读长测序分析与复杂结构变异解析。** 对3例初筛未明确的早发患者（发病年龄18、23、27岁）进行长读长全基因组测序。测序数据质量指标稳健：HiFi读长数在3,989,793至5,439,449之间，平均4,574,084；总产量平均82.34 Gb；读长N50平均17,277 bp；中位碱基质量值为Q31；全基因组平均覆盖度25.40×。长读长测序确认了MLPA检出的致病性PRKN CNV，比对数据显示外显子5和6作为一个连续片段被复制。LRS患者A中CNV侧翼内含子区域SNV纯合性约为95%，而6号染色体整体纯合性显著较低（57.82%），结合其他纳入者同区域较低的纯合性比例，表明该变异为纯合串联重复。此外，对全部参与者筛查已知与早发性帕金森综合征相关基因后，仅LRS患者A检出PRKN外显子5–6重复，未观察到其他致病性SNV或结构变异（structural variant，SV）。通过无偏倚分析（过滤标准：gnomAD总人群最小等位基因频率<1%、gnomAD拉丁裔/混血美国人<1%、CADD评分>20，并应用ACMG/AMP标准），LRS患者B和LRS患者C分别有3个和4个基因被鉴定为携带生物学相关候选变异，均为VUS。

**四、讨论与结论**

本研究表明，PRKN蛋白结构的完整性对其功能至关重要，蛋白质截短变异、结构变异和移码变异以及外显子累积功能障碍与哥伦比亚人群PD早发年龄相关。PRKN纯合和复合杂合变异（包括CNV）在EOPD中的作用已有充分文献支持；新近证据提示PRKN和PINK1杂合性也可能增加PD风险并与发病年龄降低相关。桑格测序因其高准确性和低成本在临床环境中仍具有重要意义，尤其在特定病例的遗传诊断中是合乎逻辑的实用选择。长读长测序技术有望成为揭示复杂遗传结构的重要工具，特别适用于临床研究代表性不足的人群。探索性长读长全基因组测序在LRS患者A和B中发现了ADCY2基因罕见的纯合剪接位点插入（c.2094+5_2094+6insCCCCAGAGCATGGCCGTGTTCAACATGGTAAG），该基因参与可能增加PD风险的关键信号通路并与左旋多巴诱导的异动症易感性相关；LRS患者A还携带ADH1B外显子3纯合移码截短变异；LRS患者C最显著变异为HCFC1基因错义SNV（c.3874C>A；p.P1292T），HCFC1先前已被关联至PD风险并与发育迟缓和神经系统疾病相关。

**研究结论：** 本研究通过对43例哥伦比亚EOPD患者的靶向基因筛查，鉴定出2例（4.6%）由PRKN致病性变异解释的遗传型病例——1例携带复合杂合致病性SNV（c.155delA；p.N52Mfs*29和c.1083+1G>A），另1例携带PRKN外显子5–6纯合重复。研究结果表明PRKN、PINK1和DJ-1相关的遗传型在哥伦比亚EOPD患者中较为罕见。长读长测序精确验证并可视化纯合重复的结构特征，展示了该技术在变异检测与表征中的优势。研究结果强调，将多样化人群纳入研究对于全面理解疾病遗传机制具有重要意义，未来扩大样本的长读长测序研究将有助于更深入地解析拉丁美洲及全球人群中EOPD的复杂遗传变异和结构改变。