LIPI-4与lmo0180协同调控单核细胞增生李斯特菌的鞭毛运动性及毒力

《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》：LIPI-4 and lmo0180 cooperatively regulate flagellar motility and virulence in Listeria monocytogenes

　　

摘要

引言：单核细胞增生李斯特菌（*Listeria monocytogenes*, *L. monocytogenes*）中李斯特菌毒力岛4（*Listeria* pathogenicity island 4, LIPI-4）的缺失会损害细菌运动性、破坏鞭毛组装，并显著上调*lmo0180*基因的表达。方法：本研究通过同源重组技术构建了Δ*lmo0180*单基因缺失突变株及ΔLIPI-4/*lmo0180*双基因缺失突变株。通过半固体培养基评估细菌运动性，并利用透射电子显微镜观察鞭毛生物合成。比较各菌株的黏附、侵袭、胞内增殖及细胞间传播能力。在小鼠模型中评价毒力，并通过实时荧光定量PCR定量主要毒力因子的转录水平。结果：结果表明，单独缺失*lmo0180*对细菌运动性、鞭毛形成或毒力相关表型无显著影响。相反，LIPI-4缺失增强了生物膜形成能力，并完全消除了运动性和鞭毛组装。LIPI-4与*lmo0180*同时缺失可恢复细菌运动性、*flaA*基因表达及部分鞭毛组装；然而，双基因突变株在宿主细胞中的黏附、侵袭、胞内增殖和细胞间传播能力显著降低。体内实验一致表明，感染ΔLIPI-4/*lmo0180*突变株的小鼠表现出较低的细菌载量和较轻的组织损伤。与PrfA调控的毒力基因转录水平升高的ΔLIPI-4菌株相比，ΔLIPI-4/*lmo0180*突变株中大多数此类基因的表达下调。讨论：这些转录变化可能有助于解释其减毒的毒力表型。综上，本研究表明LIPI-4与*lmo0180*之间存在遗传互作，共同影响*L. monocytogenes*的鞭毛运动性和毒力，这一发现为理解*L. monocytogenes*的致病机制提供了新见解。

《LIPI-4与lmo0180协同调控单核细胞增生李斯特菌鞭毛运动性及毒力的研究解读》

**一、研究背景与科学问题**

单核细胞增生李斯特菌（*Listeria monocytogenes*）是一种革兰氏阳性、杆状、兼性厌氧的食源性致病菌，可引起李斯特菌病，这是一种罕见但严重的人兽共患侵袭性疾病。该病对免疫功能低下者、孕妇及新生儿构成重大威胁，临床表现包括脑膜炎、脑膜脑炎、败血症、流产等，病死率高达20%至30%。李斯特菌毒力岛4（LIPI-4）最初通过多位点序列分型（MLST）分析被鉴定为与人类李斯特菌病相关的超毒力克隆复合体4（CC4）所特有的毒力基因簇，后经全基因组测序证实其为编码纤维二糖家族磷酸转移酶系统（PTS）的六基因簇，在小鼠模型中确认其对于神经毒力和胎盘毒力的关键作用。后续研究在序列型（ST）382、CC87（包括ST87和ST1459）及CC619（ST619和ST2835）等多种谱系中也检测到LIPI-4的存在。

前期研究表明，在LM928（ST87）菌株中缺失LIPI-4会导致细菌黏附、侵袭、胞内增殖及细胞间传播能力下降。值得注意的是，在28 °C条件下，ΔLIPI-4突变株的运动性显著受损，*flaA*基因表达下调35.7倍，透射电子显微镜分析确认该菌株缺乏鞭毛结构，提示鞭毛组装缺陷。此外，比较转录组学分析显示，LIPI-4缺失大幅改变了参与多种环境微生物代谢和碳代谢的基因表达。尤为突出的是，转录组数据揭示*lmo0180*基因在ΔLIPI-4菌株中显著上调，在28 °C和37 °C时转录水平分别增加290.02倍和32.00倍，在所有差异表达基因中变化倍数最高。

*lmo0180*属于七基因操纵子*lmo0178*–*lmo0184*的组成部分。该操纵子中，*lmo0178*编码木糖阻遏蛋白；*lmo0179*和*lmo0180*编码糖ABC转运蛋白通透酶；*lmo0181*编码相应的底物结合蛋白；*lmo0182*和*lmo0183*编码α-葡萄糖苷酶；*lmo0184*编码低聚-1,6-葡萄糖苷酶。*lmo0179*–*lmo0184*位点共同构成负责糖转运和代谢的ABC转运系统。该操纵子基因属于PrfA抑制的II类基因，其表达被PrfA稳定抑制。鉴于*lmo0180*在LIPI-4缺失菌株中的异常高表达及其作为毒力关键调控因子PrfA负调控靶标的身份，该研究旨在探讨LIPI-4及关联基因*lmo0180*在单核细胞增生李斯特菌鞭毛组装、生物膜形成和毒力中的作用。

**二、主要技术方法**

研究人员采用同源重组技术构建了*lmo0180*单基因缺失突变株（Δ*lmo0180*）和LIPI-4/*lmo0180*双基因缺失突变株（ΔLIPI-4/*lmo0180*）及回补菌株（CΔ*lmo0180*），并经PCR和qRT-PCR验证。通过半固体琼脂平板法和穿刺接种法评估细菌运动性（28 °C），采用透射电子显微镜（TEM）观察鞭毛组装情况，利用结晶紫染色法在48孔板中定量生物膜形成能力。体外感染实验使用人结直肠腺上皮细胞Caco-2评估黏附与侵袭能力，小鼠巨噬细胞RAW264.7评估胞内增殖能力，小鼠成纤维细胞L929通过蚀斑形成实验评估细胞间传播能力。体内毒力评价采用6至8周龄SPF级雌性昆明小鼠（购自石河子大学动物实验中心），通过腹腔注射感染后48小时检测血液、肝脏、脾脏和大脑中的细菌载量，并通过苏木精-伊红（HE）染色观察组织病理学变化。毒力相关基因转录水平采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测，以*gyrB*为内参基因，通过2^-ΔΔCt法计算相对表达量。

**三、主要研究结果**

**3.1 *lmo0180*基因缺失不影响细菌在BHI培养基中的生长**

生长曲线分析显示，Δ*lmo0180*和ΔLIPI-4/*lmo0180*菌株在37 °C BHI培养基中的生长动力学与野生型LM928和ΔLIPI-4菌株无显著差异，表明*lmo0180*单基因缺失或与LIPI-4同时缺失均不损害细菌正常生长能力。

**3.2 *lmo0180*基因缺失部分恢复ΔLIPI-4菌株的鞭毛组装和运动性**

运动性实验显示，ΔLIPI-4菌株在28 °C下运动圈直径较LM928显著减小，而Δ*lmo0180*和CΔ*lmo0180*菌株与野生型无显著差异。值得注意的是，ΔLIPI-4/*lmo0180*菌株表现出部分运动性恢复，但其运动圈仍小于LM928和Δ*lmo0180*菌株。穿刺接种实验与此一致。qRT-PCR结果显示，ΔLIPI-4菌株中*flaA*转录水平较LM928下降15.4倍，而Δ*lmo0180*菌株无显著变化；ΔLIPI-4/*lmo0180*菌株的*flaA*基因表达上调1.3倍。TEM观察发现，LM928和Δ*lmo0180*菌株均可见清晰鞭毛，ΔLIPI-4菌株无鞭毛结构，而ΔLIPI-4/*lmo0180*菌株部分恢复鞭毛组装。在可评价细胞中，带鞭毛细胞比例分别为LM928（44/44）、ΔLIPI-4（0/134）、Δ*lmo0180*（11/11）和ΔLIPI-4/*lmo0180*（2/5）。

**3.3 LIPI-4负调控单核细胞增生李斯特菌的生物膜形成**

结晶紫染色结果显示，在28 °C条件下，ΔLIPI-4菌株在24小时和48小时的生物膜形成能力均显著高于其他菌株。在37 °C条件下，ΔLIPI-4和ΔLIPI-4/*lmo0180*菌株的生物膜形成能力均显著高于LM928、Δ*lmo0180*和CΔ*lmo0180*菌株。总体而言，LIPI-4对单核细胞增生李斯特菌的生物膜形成具有负调控作用。

**3.4 LIPI-4和lmo0180对宿主细胞黏附、侵袭、胞内增殖和细胞间传播的作用**

在Caco-2细胞实验中，与野生型相比，Δ*lmo0180*菌株的黏附率显著增加，而ΔLIPI-4和ΔLIPI-4/*lmo0180*菌株的黏附能力显著降低。侵袭能力方面，ΔLIPI-4、Δ*lmo0180*和ΔLIPI-4/*lmo0180*菌株均较野生型显著降低，CΔ*lmo0180*无显著差异。在RAW264.7巨噬细胞中，所有菌株的胞内增殖均随时间增加，但除CΔ*lmo0180*在8小时无显著差异外，其余菌株在4、8和12小时的增殖水平均显著低于LM928。特别是ΔLIPI-4/*lmo0180*菌株的胞内细菌数量始终低于LM928、ΔLIPI-4和Δ*lmo0180*菌株。L929细胞蚀斑实验显示，ΔLIPI-4和ΔLIPI-4/*lmo0180*突变株的蚀斑形成能力较LM928显著降低，且ΔLIPI-4/*lmo0180*双突变株产生的蚀斑少于任一单突变株。综上，*lmo0180*单基因缺失对黏附、侵袭、胞内增殖和细胞间传播影响甚微，但LIPI-4与*lmo0180*的协同调控对胞内增殖和细胞间传播能力具有重要作用。

**3.5 LIPI-4和lmo0180双重缺失严重损害小鼠体内毒力**

小鼠感染实验显示，感染48小时后，所有五组感染单核细胞增生李斯特菌的小鼠体重均较PBS对照组显著下降，其中ΔLIPI-4/*lmo0180*组体重下降最少（5.41%），而LM928、ΔLIPI-4、Δ*lmo0180*和CΔ*lmo0180*组体重下降率分别为10.86%、12.05%、12.89%和15.30%。在肝脏、脾脏、大脑和血液中的细菌载量方面，LM928、ΔLIPI-4、Δ*lmo0180*和CΔ*lmo0180*组之间无显著差异，但ΔLIPI-4/*lmo0180*组在所有检测部位的细菌载量均显著低于其他组。组织病理学检查显示，ΔLIPI-4/*lmo0180*组仅表现轻度炎症和充血，肝脏和脾脏结构基本正常；而LM928和CΔ*lmo0180*组出现肝细胞肿胀和散在坏死灶，ΔLIPI-4和Δ*lmo0180*组则表现出最严重的组织损伤。这些结果表明，单独缺失LIPI-4或*lmo0180*不会降低毒力，反而可能略有增强；但两个基因同时缺失可显著降低单核细胞增生李斯特菌的毒力。

**3.6 LIPI-4和lmo0180调控毒力基因转录**

在37 °C BHI培养基中培养后检测毒力基因转录水平，结果显示：与LM928相比，ΔLIPI-4菌株中所有检测的毒力基因（*actA*、*hly*、*inlA*、*inlB*、*inlC*、*mpl*、*plcA*、*plcB*）转录水平均显著升高；Δ*lmo0180*菌株中除*mpl*无显著差异外，其余基因均显著下调；ΔLIPI-4/*lmo0180*菌株中*inlB*显著升高，*plcB*无显著变化，而*actA*、*hly*、*inlA*、*inlC*、*mpl*和*plcA*的转录水平显著降低。

**四、讨论总结与结论翻译**

讨论部分指出，尽管LIPI-4自2016年被鉴定为赋予小鼠模型神经和胎盘趋向性的毒力基因簇，但后续研究多局限于流行病学调查，其分子机制尚不清楚。前期研究发现ΔLIPI-4突变株在28 °C下丧失运动性和鞭毛产生能力，但除*flaA*外其他经典鞭毛基因转录无显著变化，提示LIPI-4通过非经典途径调控鞭毛生物合成。本研究通过遗传学分析证明*lmo0180*的缺失可部分挽救LIPI-4缺失引起的鞭毛缺陷，揭示了这两个位点间此前未被认识的遗传互作。关于鞭毛运动性与生物膜形成的关系，研究结果支持二者关系高度依赖具体遗传背景和环境条件的观点：LIPI-4缺失增强生物膜形成，而额外缺失*lmo0180*在28 °C下部分恢复生物膜表型，但在37 °C下未恢复，提示温度依赖性调控通路可能参与LIPI-4与*lmo0180*的功能互作。体外感染实验表明，尽管ΔLIPI-4/*lmo0180*双突变株恢复了部分鞭毛组装和运动性，但其黏附、侵袭、胞内增殖和细胞间传播能力却显著低于ΔLIPI-4单突变株，说明鞭毛组装的恢复不足以恢复毒力，LIPI-4对致病性的贡献超越其对鞭毛生物发生的影响。此外，ΔLIPI-4菌株中PrfA调控的毒力基因（8/8）均显著上调，同时*lmo0180*表达也显著增加，而ΔLIPI-4/*lmo0180*菌株中大多数PrfA调控基因下调，这些转录变化可能有助于解释双突变株的减毒表型。讨论还指出，单核细胞增生李斯特菌的鞭毛生物合成受MogR-GmaR调控系统的温度依赖性调节，而鞭毛在该菌毒力中的作用仍有争议，多项研究表明鞭毛基因的破坏虽消除了运动性并损害了培养上皮细胞的黏附和侵袭，但在小鼠感染模型中几乎没有或仅轻微降低毒力。关于LIPI-4与*lmo0180*互作的分子基础，研究人员认为*lmo0180*可能作为受LIPI-4缺失影响的细胞过程的调节因子，补偿LIPI-4相关功能的丧失，但具体机制仍需通过结合比较转录组学和蛋白质组学分析及回补实验加以阐明。

结论：本研究证明LIPI-4与*lmo0180*存在功能性互作，共同影响单核细胞增生李斯特菌的鞭毛组装、细菌运动性和毒力相关表型。尽管单独缺失*lmo0180*对运动性或毒力几乎没有可检测的影响，但在ΔLIPI-4背景中缺失*lmo0180*可部分恢复*flaA*表达、鞭毛组装和细菌运动性。相反，ΔLIPI-4/*lmo0180*双突变株在细胞培养和小鼠感染模型中均表现出显著降低的黏附、侵袭、胞内增殖、细胞间传播能力及毒力。此外，ΔLIPI-4突变株中PrfA调控的毒力基因转录增加，而ΔLIPI-4/*lmo0180*双突变株中大多数此类基因表达降低。这些转录变化可能有助于双突变株减毒表型的形成。综上所述，该研究为LIPI-4与*lmo0180*遗传互作影响单核细胞增生李斯特菌运动性和致病性提供了新证据，为理解LIPI-4相关毒力的分子基础提供了新见解。该论文发表在《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》。