多组学分析鉴定溃疡性结肠炎中巨噬细胞免疫代谢特征

《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》：Multi-omics analysis identifies macrophage immunometabolic signatures in ulcerative colitis

　　

摘要
背景：溃疡性结肠炎（ulcerative colitis, UC）是一种慢性炎症性肠病，以肠道免疫失调和黏膜屏障功能障碍为特征。巨噬细胞在肠道免疫中发挥核心作用，但其在UC中的代谢重编程及异质性尚未得到充分表征。方法：研究人员整合单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）、 bulk转录组学、加权基因共表达网络分析（weighted gene co-expression network analysis, WGCNA）及机器学习算法（LASSO、SVM-RFE和随机森林），以鉴定UC中巨噬细胞相关的候选代谢调控因子。利用拟时间轨迹、CellChat和功能富集分析评估分化、细胞间相互作用及通路参与情况。采用ROC曲线评估诊断性能，并在独立数据集中进行验证。实验验证采用苏木精-伊红（Hematoxylin and Eosin, H&E）染色进行组织病理学评估，并通过蛋白质印迹法（Western blotting）分析蛋白表达。结果：scRNA-seq鉴定出505个巨噬细胞特异性基因，拟时间分析提示以RGCC和FOSL2为标志的分化分支。转录组分析揭示1058个差异表达基因，富集于TNF、上皮-间质转化和NF-κB通路。通过WGCNA和机器学习分析鉴定出6个巨噬细胞相关免疫代谢基因（CYBB、CR1、INPP5D、CTSH、IFI16和NCF4）。这些基因与巨噬细胞浸润和细胞因子信号传导密切相关，并显示出较高的诊断性能（AUC > 0.98），尽管不能完全排除潜在的过拟合。共识聚类将UC患者分为两个分子亚型，其中Cluster 1呈现促炎表型。H&E染色证实UC组织中存在特征性黏膜炎症和上皮损伤，而蛋白质印迹法验证了UC组织中六个关键调控因子的上调。结论：这项多组学分析鉴定了6个巨噬细胞代谢调控因子（CYBB、CR1、INPP5D、CTSH、IFI16和NCF4），它们在UC中具有潜在的诊断相关性。实验验证为其与UC中巨噬细胞相关免疫代谢改变的关联提供了支持性证据。

论文解读：多组学分析揭示溃疡性结肠炎中巨噬细胞免疫代谢特征

一、研究背景与目的

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis, UC）是炎症性肠病（inflammatory bowel disease, IBD）的主要亚型之一，以慢性复发性结肠炎症为特征，全球疾病负担沉重。传统上北美和欧洲发病率较高，年发病率达10–20/10万；近年来亚洲尤其是中国发病率快速上升，城市地区发病率接近8.2/10万。这一流行病学变化与生活方式改变、城市化及肠道菌群变化相关，提示UC已成为紧迫的公共卫生挑战。UC的发病机制涉及遗传易感性、环境触发因素和免疫失调的复杂相互作用。尽管bulk RNA测序已揭示UC组织的转录组改变，但无法解析细胞异质性。单细胞RNA测序（scRNA-seq）能够高分辨率表征UC中免疫细胞的多样性和分化状态，但不同疾病阶段的细胞状态仍未完全阐明，多组学整合仍然有限，候选标记基因的系统验证也较为缺乏。

巨噬细胞是肠道固有层中最丰富的固有免疫细胞，在病原体清除、抗原呈递和细胞因子产生中发挥核心作用。其可塑性使其能够动态适应环境信号，但在UC中，巨噬细胞活化失调持续驱动慢性炎症。促炎性M1与抗炎性M2巨噬细胞之间的失衡，以及与T细胞、B细胞等其他免疫亚群的广泛串扰，放大了炎症级联反应。然而，连接巨噬细胞异质性与UC进展的遗传和分子机制仍不清楚。近年研究强调免疫代谢重编程是巨噬细胞极化和功能的关键决定因素，但这一概念在UC中的贡献及其遗传基础尚未被充分探索。基于上述空白，本研究旨在整合scRNA-seq和bulk转录组学，鉴定与UC中巨噬细胞异质性和代谢改变相关的巨噬细胞相关免疫代谢特征，并通过分子生物学技术进行靶向验证，以期为UC的精准分层提供潜在生物标志物。

二、主要技术方法

研究人员利用基因表达综合（GEO）数据库中的5个数据集（GSE162335、GSE48958、GSE73661、GSE75214和GSE16879），共纳入220个样本。scRNA-seq数据集GSE162335仅含UC来源样本，经过严格质控后获得17,936个细胞和19,402个基因。bulk转录组数据集经affy包标准化和批次校正。主要技术流程包括：使用Seurat进行scRNA-seq数据降维、聚类和细胞注释；通过Monocle构建巨噬细胞分化轨迹；利用CellChat推断细胞间配体-受体相互作用；采用limma包进行差异表达分析；基于CIBERSORT、EPIC、ssGSEA和TIMER四种算法评估免疫浸润；应用加权基因共表达网络分析（WGCNA）鉴定与巨噬细胞浸润相关的基因模块；使用LASSO-logistic回归、支持向量机-递归特征消除（SVM-RFE）和随机森林三种机器学习算法筛选特征基因；通过共识聚类（ConsensusClusterPlus）对UC患者进行分子分型；实验验证采用苏木精-伊红（H&E）染色和蛋白质印迹法检测UC及对照结肠组织中的蛋白表达。所有人体组织实验均经山西省人民医院伦理委员会批准。

三、研究结果

1. 通过scRNA-seq鉴定巨噬细胞特征基因

研究人员分析了来自11例UC原发样本的17,936个细胞的scRNA-seq图谱。经质控、归一化后选择前3,000个高变基因进行PCA分析，识别出20个显著主成分，UMAP降维解析出20个细胞簇。结合PanglaoDB和CellMarker 2.0注释，共鉴定出505个巨噬细胞相关基因，代表标记基因包括MS4A1、BANK、VPREB3、HLA-DRA和HLA-DQA1等。这些结果为UC中巨噬细胞特异性特征提供了全面目录。

2. 巨噬细胞亚群的分化轨迹和功能特征

拟时间轨迹分析描绘了UC巨噬细胞的三个发育分支：前分支、细胞命运1和细胞命运2。差异基因热图显示阶段特异性表达模式，关键调控因子包括RGCC（细胞周期和凋亡相关）、FOSL2（驱动巨噬细胞活化和分化的转录因子）、ID2（调节淋巴和髓系分化）及PHLDA1（凋亡和应激反应相关）。CellChat分析揭示巨噬细胞与滤泡辅助T细胞、单核细胞之间存在广泛的配体-受体串扰。GO和KEGG富集分析显示巨噬细胞标记基因富集于免疫应答、抗原受体介导的信号传导和核糖体过程，以及B细胞受体信号和NF-κB信号通路。

3. UC RNA-seq数据中的差异表达基因

整合三个bulk数据集共220个样本，经SVA批次校正后，差异表达分析鉴定出1,058个差异表达基因。Hallmark富集显示免疫相关通路上调，如异体移植排斥、补体级联、上皮-间质转化和TNF信号；下调基因富集于脂肪酸代谢、脂肪生成和外源物代谢。GO和KEGG分析提示白细胞增殖和趋化，以及NF-κB、PI3K-Akt、B细胞受体和TNF信号通路参与。

4. WGCNA巨噬细胞相关基因模块

免疫浸润评分经四种算法评估后作为表型特征。WGCNA采用软阈值18构建无标度网络，识别出5个基因模块。其中蓝色（167个基因）、棕色（128个基因）和黄色（125个基因）模块与巨噬细胞浸润评分呈强正相关（R > 0.70，P < 0.001），共420个基因被视为巨噬细胞相关模块基因。

5. 巨噬细胞相关免疫代谢候选基因筛选

将WGCNA模块基因、代谢基因集和scRNA-seq巨噬细胞标记基因取交集，获得13个候选基因。通过三种机器学习算法的交集，最终确定6个特征基因：CYBB、CR1、INPP5D、CTSH、IFI16和NCF4。这些基因可重复地作为候选巨噬细胞相关免疫代谢标记。

6. 特征基因的诊断性能和临床效用

ROC曲线分析显示，在训练集中6个特征基因的AUC值为0.81–0.99，其中IFI16（AUC = 0.9902）和CTSH（AUC = 0.9798）表现最佳。验证集确认了优异的诊断性能（AUC 0.92–1.0），IFI16达到1.0。包含全部6个基因的列线图提供了稳健的预测准确性，决策曲线分析证明了临床效用。但研究人员指出，极高的AUC值需谨慎解读，因为多步骤特征选择过程和相对有限的队列规模可能增加过拟合风险。

7. 特征基因与巨噬细胞的相关性

Spearman相关分析显示6个特征基因均与巨噬细胞免疫评分显著正相关，其中CYBB（R = 0.86）和CR1（R = 0.85）相关性最强，其次是NCF4（R = 0.84）、IFI16（R = 0.83）、CTSH（R = 0.79）和INPP5D（R = 0.71）。这提示这些基因与巨噬细胞活性密切相关。

8. 特征基因在UC巨噬细胞中的功能角色

差异表达和GSEA富集分析显示6个特征基因显著参与免疫和炎症通路，特别是补体和凝血级联以及细胞因子-细胞因子受体相互作用。UMAP聚类显示这些基因在巨噬细胞富集区域高表达，CYBB和CR1尤为突出，提示其在巨噬细胞代谢重编程中的关键功能。

9. 基于特征基因表达的UC分子亚型

对148例UC患者进行共识聚类，确定了两个稳定亚型（K = 2），分别包含84例和64例。PCA确认亚型间清晰分离。Cluster 1中CYBB、CR1和INPP5D表达显著高于Cluster 2，呈现代谢活跃和促炎特征。进一步比较28种免疫细胞亚群浸润分数，25种免疫细胞在亚型间存在显著差异（P < 0.001），仅CD56bright自然杀伤细胞、CD56dim自然杀伤细胞和Th17细胞无显著差异，提示两种UC分子亚型具有根本不同的黏膜免疫微环境。

10. 组织学和蛋白水平验证

H&E染色显示UC组织存在广泛上皮破坏、隐窝变形、杯状细胞耗竭和固有层炎性细胞密集浸润，而对照组织上皮结构完整。蛋白质印迹分析显示UC组织中6个巨噬细胞相关代谢调控因子（CYBB、CR1、INPP5D、CTSH、IFI16和NCF4）均显著上调（n=3，UC vs. 对照）：CR1为1.80 ± 0.28倍，INPP5D为2.87 ± 0.88倍，CYBB为2.02 ± 0.29倍，IFI16为1.58 ± 0.15倍，NCF4为1.66 ± 0.39倍，CTSH为1.53 ± 0.12倍（均P < 0.05），与转录组预测一致。

四、讨论与结论

研究人员指出，这是首个通过scRNA-seq绘制UC巨噬细胞分化图谱的研究，鉴定出505个巨噬细胞特异性基因。拟时间分析表明UC巨噬细胞具有独特分化分支。CellChat分析揭示了巨噬细胞与滤泡辅助T细胞的广泛串扰，巨噬细胞可能通过分泌IL-6、IL-1β及上调ICOSL激活Tfh细胞，而Tfh细胞通过CD40L和IL-21增强巨噬细胞活化。bulk转录组显示上调基因富集于TNF信号和EMT，下调基因富集于脂肪酸氧化和线粒体电子传递，提示向糖酵解的代谢转变，与促炎巨噬细胞免疫代谢重编程一致。6个特征基因中，CYBB和NCF4是NADPH氧化酶复合物组分，与ROS产生相关；INPP5D（SHIP-1）抑制PI3K-Akt信号；CTSH是溶酶体半胱氨酸蛋白酶；IFI16是DNA感受器。尽管CYBB和IFI16已被广泛研究与炎症相关，但CR1、NCF4和CTSH在UC中的直接证据仍有限。研究人员强调，这些基因应解释为巨噬细胞相关免疫代谢标记，而非确定的代谢调控因子，需要进一步巨噬细胞特异性扰动实验来确立因果关系。研究局限性包括：scRNA-seq仅含UC样本缺乏健康对照，实验验证队列较小（每组n=3），潜在过拟合风险无法排除，以及作为观察性研究不能建立因果关系。结论：多组学分析鉴定了6个候选巨噬细胞相关免疫代谢标记（CYBB、CR1、INPP5D、CTSH、IFI16和NCF4），在UC中具有潜在的机制相关性和诊断价值，结合组织学和蛋白水平验证，拓展了对巨噬细胞免疫代谢的理解，并为疾病分层提供了潜在生物标志物。