《Frontiers in Plant Science》：Comparative in silico analysis of miRNA targeting of NAC and MYB transcription factors associated with secondary cell wall regulation in rice and maize
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摘要
纤维素生物合成和次生细胞壁形成受涉及NAC和MYB转录因子及其受miRNA转录后调控的分层网络调控。研究人员使用MirTarget对粳稻（O. sativa subsp. japonica）和玉米（Z. mays）完整注释的NAC和MYB转录因子基因集
摘要
纤维素生物合成和次生细胞壁形成受涉及NAC和MYB转录因子及其受miRNA转录后调控的分层网络调控。研究人员使用MirTarget对粳稻（O. sativa subsp. japonica）和玉米（Z. mays）完整注释的NAC和MYB转录因子基因集进行了跨物种in silico分析，并利用psRNATarget对选定的高优先级相互作用进行了独立评估。在170个水稻NAC基因中的138个（81.2%）、130个水稻MYB基因中的110个（84.6%）、189个玉米NAC基因中的87个（46.0%）和203个玉米MYB基因中的117个（57.6%）中预测到miRNA结合位点（BSs），分别对应591、480、331和487个预测位点。miR164家族成员在两种物种的NAC候选基因中占主导地位，而MYB转录本则表现出更大的miRNA多样性。该分析恢复了已确立的miR164–NAC和miR159–MYB模块作为阳性基准。相比之下，miR5075-3p–LOC_Os04g38740.1作为领先的新型转录本特异性候选出现，并获得了MirTarget和psRNATarget的一致性计算支持。这些发现界定了预测miRNA靶向的比较模式而非经实验验证的调控相互作用，并为直接功能测试提供了优先化的假设。
**水稻与玉米中调控次生细胞壁的NAC和MYB转录因子miRNA靶向比较性in silico分析：论文解读**
**1. 研究背景**
植物细胞壁是复杂且高度有序的结构，在植物生长、机械支撑和环境适应中发挥着基础性作用。纤维素作为地球上最丰富的生物聚合物，是初生和次生细胞壁（SCW）的主要承力组分，是植物生物量积累和结构完整性的关键决定因素。解析调控纤维素生物合成的分子机制对于改良植物生物质品质及推进源自植物资源的环保应用至关重要。纤维素生物合成由纤维素合酶（CesA）复合体和协调调控SCW形成相关基因的转录因子网络所 orchestrated。其中，NAC和MYB转录因子家族发挥着核心且保守的作用：NAC转录因子被广泛认为是SCW生物合成的master regulators，控制下游MYB基因以及参与纤维素、半纤维素和木质素合成的结构基因；MYB转录因子则作为关键调节因子，微调细胞壁生物合成基因的表达，并参与次生壁沉积的组织特异性和发育调控。NAC和MYB转录因子的协同活动形成分层调控网络，对于水稻（Oryza sativa）和玉米（Zea mays）等谷类作物的正常细胞壁形成至关重要。
在转录控制之外，转录后调控已成为植物基因表达调控的关键层面。微小RNA（miRNAs）是一类长度通常为20–24个核苷酸的小型非编码RNA，通过引导与靶mRNA的序列特异性相互作用来调控基因表达，导致mRNA切割或翻译抑制。已有多个植物miRNA家族被证实参与NAC和MYB转录因子的调控，然而，以往研究多集中于单个miRNA–基因对或特定发育情境，针对完整NAC和MYB转录因子家族的miRNA靶向进行系统性跨物种比较的研究仍然有限。因此，开展跨物种的系统性比较分析，对于揭示这些重要调控组分的潜在保守与物种相关靶向模式具有重要意义。
**2. 研究策略与主要技术方法**
研究人员对粳稻（O. sativa subsp. japonica）和玉米（Z. mays）完整注释的NAC和MYB转录因子基因集进行了系统的跨物种in silico分析。成熟miRNA序列来自miRBase数据库，mRNA序列来自植物转录因子数据库（PlantTFDB）。利用MirTarget程序预测miRNA–mRNA相互作用，该程序基于序列互补性和热力学稳定性评估结合位点（BS），计算结合自由能（ΔG）和相对结合效率（ΔG/ΔGm）。采用ΔG ≤ ?106 kJ/mol作为严格的操作性过滤标准，优先筛选热力学上最有利的候选相互作用。此外，利用psRNATarget对选定的高优先级相互作用进行独立计算验证。同时，利用PlantTFDB中集成的Expression Atlas模块获取水稻NAC基因的公开表达数据，并使用TBtools软件进行热图可视化，作为探索性评估。
**3. 主要研究结果**
**3.1 水稻中关于NAC和MYB转录因子基因的miRNA靶向预测**
在170个水稻NAC基因中，138个转录本包含591个预测BSs，涉及181个miRNAs。经严格标准过滤后，在27个NAC基因中保留了涉及10个miRNAs的43个候选BSs。miR164家族成员是主要候选组，与多个NAC转录本相关。在130个水稻MYB基因中，110个转录本包含480个预测BSs。经严格标准过滤后，11个miRNAs与20个MYB基因相关，其中miR2102-5p和miR5075-3p表现出最广泛的候选靶标分布。预测的miR5075-3p–LOC_Os04g38740.1相互作用在21-nt结合区域表现出近乎完全的互补性，ΔG值约为?113 kJ/mol，被确定为高优先级候选。miR159c-3p–LOC_Os05g41166.1也因其广泛的序列互补性而被保留为候选。psRNATarget独立验证支持了这两个选定候选相互作用。
**3.2 玉米中关于NAC和MYB转录因子基因的miRNA靶向预测**
对玉米的全基因组in silico分析在87个NAC转录本中鉴定出106个miRNAs的预测BSs，共计331个BSs。经严格标准过滤后，在11个NAC基因中保留了涉及9个miRNAs的42个候选BSs，其中大多数涉及miR164-5p家族成员。在MYB基因中，117个基因包含487个预测BSs，涉及102个miRNAs。经严格标准过滤后，miR159e-5p是主要候选miRNA，在多个MYB转录本中形成预测BSs。
**3.3 关键预测相互作用的独立计算交叉验证**
为提供独立计算支持，研究人员使用psRNATarget重新评估了两个高优先级的水稻miRNA–MYB候选相互作用。osa-miR5075-3p–LOC_Os04g38740.1的MirTarget预测位点起始于403 nt，psRNATarget独立鉴定了跨越403–423 nt的候选位点，两者位置直接对应。osa-miR159c-3p–LOC_Os05g41166.1的MirTarget预测位点起始于809 nt，psRNATarget预测了跨越810–829 nt的位点，与MirTarget预测区域密切对应。两个选定相互作用均获得两种独立计算工具的一致性支持。
**3.4 跨物种定量比较**
水稻中NAC和MYB基因含有预测miRNA BSs的比例（81.2%和84.6%）显著高于玉米（46.0%和57.6%），差异具有统计学意义。按基因数标准化后，水稻NAC和MYB基因每分析基因分别含3.48和3.69个预测BSs，而玉米相应值为1.75和2.40。这些结果表明水稻中预测的miRNA靶向密度更高，但该差异是基于计算预测数据集的定量差异，而非物种水平生物学调控的直接证据。
**4. 总结与结论**
讨论部分指出，miR164–NAC和miR159–MYB模块获得了已发表实验证据的支持，包括RLM-5′ RACE检测到的切割产物、表达模式分析及遗传功能证据，这些被用作本研究的阳性基准。然而，本研究中预测的许多转录本特异性相互作用仍属于计算候选，尤其强调了miR5075-3p–LOC_Os04g38740.1作为领先的可测试计算假说，其优先性基于有利的热力学参数、近乎完全的互补性以及双工具的一致性预测。
本研究提供了水稻和玉米完整注释NAC和MYB转录因子基因集中预测miRNA靶向的比较性in silico特征分析。研究发现水稻中NAC和MYB基因含有预测miRNA BSs的比例高于玉米，而按基因数标准化后确认了两个物种和转录因子家族之间不同的定量靶向模式。分析恢复了已确立的miR164–NAC和miR159–MYB模块作为阳性基准，并将转录本特异性预测与实验支持的相互作用区分开来。在新候选基因中，miR5075-3p–LOC_Os04g38740.1被优先化为领先的可测试计算假说，具备有利的热力学参数、近乎完全的互补性和MirTarget与psRNATarget的一致性预测。miR159c-3p–LOC_Os05g41166.1相互作用也获得了独立计算支持。这些优先化候选基因为未来的degradome、reporter-based和位点特异性功能验证提供了具体靶标。本研究作为一篇系统性跨物种计算分析，为深入理解NAC和MYB转录因子家族在次生细胞壁调控中的miRNA介导的转录后调控提供了优先化假说和重要参考框架。
