《Frontiers in Veterinary Science》：Porcine interferon-alpha but not interferon-lambda inhibits replication of genotypically diverse PRRSV isolates in vitro
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摘要
引言：猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是一种对养猪业造成严重经济损失的病毒性感染，估计每年损失达12亿美元。由于机体对该病毒适应性免疫应答较弱且发育迟缓，猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的控制一直面临挑战。这在一定程度上归因于宿主干扰素（IFN）诱导
摘要
引言：猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是一种对养猪业造成严重经济损失的病毒性感染，估计每年损失达12亿美元。由于机体对该病毒适应性免疫应答较弱且发育迟缓，猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的控制一直面临挑战。这在一定程度上归因于宿主干扰素（IFN）诱导水平较低。IFN是能够在靶细胞中诱导抗病毒状态并促进针对病毒的适应性免疫应答发展的细胞因子。外源性IFN的应用在养猪业控制PRRSV方面具有研究价值。
方法：研究人员评估了猪干扰素-α（pIFNα）和猪干扰素-λ（pIFNλ）在体外使用基因型多样的PRRSV分离株亚群抑制猪肺泡巨噬细胞中PRRSV复制的能力。此外，由于许多细胞因子产品在体内的效用受到半衰期和给药间隔的限制，研究人员还评估了PEG化修饰的pIFNα构建体抑制PRRSV复制的能力。
结果：猪IFNα比pIFNλ更有效地抑制PRRSV复制并诱导更高水平的干扰素刺激基因转录；然而，PRRSV抑制效果具有毒株依赖性。PEG化pIFNα在预处理细胞中同样能降低PRRSV复制，但其抑制效率相较于野生型pIFNα有所下降。
讨论：猪IFNα被证明更能有效抑制PRRSV复制，但部分毒株对pIFN治疗的敏感性较低。本研究工作表明，PEG化pIFNα保留了一定的功能活性，并具有作为控制猪PRRSV复制的生物治疗产品的潜力。
**论文解读：猪干扰素-α对基因型多样性PRRSV分离株的体外抑制作用及其PEG化修饰研究**
**1. 研究背景与意义**
猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起的一种全球性猪传染病，以繁殖障碍和呼吸系统疾病为主要临床特征，给全球养猪业造成估计每年12亿美元的经济损失。PRRSV感染的一个显著特点是机体无法产生强烈而及时的干扰素（IFN）应答，这导致适应性免疫发育延迟和病毒清除缓慢，进而造成持续感染和免疫抑制。IFN作为先天免疫和适应性免疫的重要细胞因子，能够在靶细胞中诱导抗病毒状态、限制病毒复制并促进免疫监视和感染细胞清除。然而，I型IFN在猪体内的半衰期较短，给药后血清IFN水平迅速回落至基线水平，限制了其临床应用效果。本研究旨在评估重组猪IFN-α（pIFNα）和猪IFN-λ（pIFNλ）对基因型多样的PRRSV分离株在猪肺泡巨噬细胞（PAMs）中复制的抑制作用，并进一步探讨PEG化修饰对pIFNα抗病毒活性的影响，为开发有效的PRRSV生物治疗制剂提供科学依据。
**2. 技术方法概要**
研究人员利用大肠杆菌表达系统制备了重组pIFNα和pIFNλ1蛋白，并通过位点特异性整合非天然氨基酸p-乙酰基-L-苯丙氨酸（pAcF）技术构建了3个PEG化pIFNα构建体（E103、E107、L112）。研究使用了9株基因型多样的PRRSV毒株，涵盖1型（Lelystad）、2型（MN-184、NADC-8、NADC-20、NADC-30、VR2332）及高致病性分离株（SRV07、JXwn06、SDSU73）。原代猪肺泡巨噬细胞采集自健康混合品种猪只的肺灌洗液。病毒复制水平通过TCID50测定和实时荧光定量RT-PCR（RT-qPCR）评估，干扰素刺激基因（ISG）转录水平通过SYBR Green法检测，以β-actin为内参，采用2^-??Ct法计算相对表达量，并经GraphPad Prism软件进行统计学分析。此外，研究还使用MARC-145细胞和PK-15细胞进行了细胞系层面的功能性验证。
**3. 主要研究结果**
**3.1 pIFNα和pIFNλ1在PAMs中预防PRRSV复制的效果评估**
研究发现，pIFNα以剂量依赖性方式抑制SDSU73毒株的复制，其中1,000 ng/mL处理组在感染后12、24、36和48小时均完全抑制病毒复制。而pIFNλ1在所有测试剂量和时间点均未显示出对PRRSV复制的显著抑制作用。在24和48小时感染后，100 ng/mL和1,000 ng/mL的pIFNα处理组的病毒滴度显著低于未处理对照组（p < 0.01），而10 ng/mL pIFNα及所有剂量的pIFNλ1处理组与对照组无显著差异。后续实验选用1,000 ng/mL作为实验剂量。
**3.2 pIFNα和pIFNλ1对不同基因型PRRSV分离株的抑制效果**
在PAMs中使用TCID50法评估了8株PRRSV分离株对pIFN处理的敏感性差异。结果显示，pIFNα对大多数测试毒株的复制抑制效果显著优于pIFNλ1，但抑制效果具有毒株依赖性。NADC-8和VR2332两株病毒对pIFNα的敏感性较低，在感染后期（36-48小时）恢复了复制能力。pIFNλ1处理组中，NADC-30毒株表现出相对较高的敏感性，但其抑制作用仅限于早期时间点（12-24小时）。RT-qPCR检测亚群毒株的病毒RNA水平虽未达到统计学显著差异，但在趋势上显示pIFNα处理组的病毒RNA浓度低于pIFNλ1处理组和未处理组。
**3.3 pIFNα和pIFNλ1在MARC-145细胞中对PRRSV感染的抑制效果**
鉴于IFNλ受体在上皮细胞中表达更为丰富，研究人员在来源于非洲绿猴肾上皮细胞的MARC-145细胞中进行了验证。结果表明，pIFNα在所有时间点均能有效抑制SDSU73复制，而pIFNλ1仅在感染后36小时表现出显著抑制效果，其他时间点无显著差异。这进一步证实pIFNα具有更强的广谱抗PRRSV活性。
**3.4 PAMs和PK-15细胞中ISG转录诱导评估**
在PAMs中，pIFNα处理在4、8、12和24小时时间点显著诱导了IL1β、Mx和PKR的转录上调，并在4、8和24小时显著诱导了MCP-1的转录；pIFNλ1也诱导了MCP-1、Mx和PKR的转录上调，但在早期时间点（4和8小时）的转录水平显著低于pIFNα处理组。随时间推移，pIFNα刺激的ISG转录水平逐渐下降，而pIFNλ1表现出更为持久的激活效应，至24和48小时时两种处理组间的转录水平趋于一致。在PK-15细胞中观察到类似现象，pIFNα刺激的ISG转录水平总体高于pIFNλ1，表明pIFNα在非上皮细胞和上皮细胞中均具有更强的ISG诱导能力。
**3.5 PEG化pIFNα构建体在MARC-145细胞中的效果评价**
与野生型pIFNα相比，3种PEG化pIFNα构建体（E103、E107、L112）在所有时间点的抗PRRSV复制效果均有降低，但在1,000 ng/mL高浓度处理下仍能显著抑制病毒复制，且不同PEG化位点间的抗病毒活性差异较小。
**4. 结果讨论与结论**
本研究首次系统比较了pIFNα和pIFNλ1对基因型多样的PRRSV分离株的体外抑制效果。综合结果表明，pIFNα在抑制PRRSV复制和诱导ISG转录方面均优于pIFNλ1，是更具潜力的PRRSV干预候选药物。不同PRRSV毒株对IFN治疗的敏感性差异显著，这提示在临床应用中需考虑毒株特异性因素。PEG化修饰虽降低了pIFNα的体外抗病毒活性，但高剂量下仍保持良好的抑制效果，结合其延长的半衰期和持久的药效时间，PEG化pIFNα构建体具有作为控制猪PRRSV复制的生物治疗产品的应用潜力，有必要开展进一步的药代动力学和体内药效学研究。
