BECC438与BECC470佐剂在铜绿假单胞菌疫苗配方中的免疫原性与保护效力比较

《Frontiers in Immunology》：Comparative immunogenicity and protective efficacy of BECC438 and BECC470 adjuvants in a vaccine formulation against Pseudomonas aeruginosa

　　

针对机会性病原体铜绿假单胞菌（*Pseudomonas aeruginosa*，Pa）的有效疫苗开发，对于易感人群而言仍是关键的公共卫生优先事项，部分原因在于该病原体固有的耐药机制。本研究评估了两种新型脂质A模拟物佐剂BECC438（BECC438s或BECC438b）和BECC470（BECC470s或BECC470b）在亚单位疫苗（L-PaF——Pa III型分泌系统蛋白PcrV和PopB与LTA1（产肠毒素大肠杆菌热不稳定肠毒素活性部分）的基因融合体）中的比较免疫原性与保护效力，该疫苗配制成水包油（oil-in-water，o/w）乳剂以靶向Pa。BECC438b和BECC470b是利用细菌酶组合化学（Bacterial Enzymatic Combinatorial Chemistry，BECC）平台生产的生物来源脂质A类似物。相比之下，BECC438s和BECC470s是化学合成的对应物，旨在实现高纯度，消除可能干扰选择性Toll样受体4（Toll-like receptor 4，TLR4）激活的同系物，同时最大限度地降低潜在反应原性。研究人员通过鼻内（intranasal，IN）或肌内（intramuscular，IM）途径向小鼠施用含有BECC438或BECC470与Pa抗原的疫苗配方，随后评估免疫应答和Pa攻击后的肺部细菌载量。IN免疫接种BECC438s或BECC438b可诱导强烈的抗原特异性IgG和IgA应答，其IgG1/IgG3谱型均衡，表明Th1/Th2混合极化，但IgG1仍为主要抗体亚类。BECC438s在IN免疫后通过降低细菌载量和改善免疫应答，赋予了针对Pa攻击的最高保护力。此外，IN递送的L-PaF/ME/BECC438s提供的保护力优于IM免疫。血清抗体滴度以及攻击前或攻击后的细胞因子应答与Pa肺部攻击后的细菌清除直接相关。这些发现表明，在该感染模型中，BECC438较BECC470能增强黏膜和系统性免疫，使其成为纳入黏膜下一代Pa疫苗的有前景候选佐剂。总体而言，这项比较分析突显了BECC来源佐剂在IN免疫后改善针对多重耐药病原体（如Pa）疫苗效能的潜力。需要进一步研究以评估其在人群中的转化潜力。

# 论文解读：BECC438与BECC470佐剂在铜绿假单胞菌疫苗中的比较免疫原性与保护效力

## 研究背景与目的

铜绿假单胞菌（*Pseudomonas aeruginosa*，Pa）是一种革兰阴性机会性病原体，对免疫功能低下人群构成重大威胁，尤其是囊性纤维化（cystic fibrosis，CF）、烧伤创面或呼吸机相关性肺炎患者。其固有的抗生素耐药机制加上获得新耐药机制的能力，使许多传统治疗手段失效，世界卫生组织（WHO）因此将Pa列为新抗菌策略开发的 critical priority pathogen。2019年全球超过50万例死亡归因于Pa感染，其中25万以上与抗菌药物耐药（antimicrobial resistance，AMR）相关。2021至2022年间，亚洲和非洲多重耐药（multidrug-resistant，MDR）Pa流行率达46%，19.6%分离株被归类为广泛耐药（extensively drug-resistant，XDR）。尽管研究广泛，目前仍无获批的Pa疫苗。Pa的遗传多样性和抗原变异性限制了许多靶向菌株特异性组分的疫苗效力。相比之下，高度保守的III型分泌系统（type III secretion system，T3SS）蛋白PcrV和PopB（序列保守性>96%）是有前景的抗原靶点。研究人员先前已证明，将PcrV和PopB与大肠杆菌热不稳定肠毒素双突变体（dmLT）经鼻内（IN）给药可保护小鼠免受肺部Pa攻击，并开发了自佐剂融合蛋白L-PaF（PcrV-PopB与LTA1的基因融合体）。佐剂在调节免疫应答的强度和质量方面发挥关键作用。细菌酶组合化学（BECC）平台能产生新型脂质A类似物，选择性靶向MD-2/TLR4受体复合物。BECC438b和BECC470b是两种工程化脂质A衍生物，在保留免疫刺激特性的同时最大限度降低内毒素毒性。近年来，高纯度化学合成形式（BECC438s和BECC470s）已被开发出来，其物理性质与生物来源对应物不同。然而，BECC438（b和s）与BECC470（b和s）在Pa疫苗接种中的比较免疫原性和保护效力尚未被探索。本研究旨在评估含有BECC438和BECC470的疫苗配方在小鼠肺部Pa感染模型中的免疫原性谱和保护结局。

## 主要技术方法

研究人员使用C57BL/6J雌性小鼠（6–8周龄，每组n=10，Jackson Laboratories来源），在第0、14、28天通过IN或IM途径免疫。疫苗配方包括PBS对照和L-PaF（1 μg）/ME（角鲨烯-based水包油乳剂）分别与0.5 μg BECC438b、BECC438s、BECC470b或BECC470s组合。L-PaF蛋白在大肠杆菌HMS174(DE3)中表达，经IMAC和Q阴离子交换层析纯化。第56天进行终末分析（每组n=5用于免疫学分析，n=5用于攻击研究）。主要技术包括：酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血清IgG、IgA及IgG1/IgG3亚类滴度；调理吞噬杀伤（OPK）试验使用J774A.1小鼠巨噬细胞和临床Pa菌株mPa08-31（CF患者分离株）评估抗体功能；攻击研究通过IN给予4×10⁷ CFU/30 μL mPa08-31，2天后测定肺载菌量；细胞因子测定使用Meso Scale Discovery（MSD）U-PLEX平台检测IFN-γ、IL-17A、IL-2、IL-22、IL-6和TNF-α。

## 研究结果

### 1. BECC438和BECC470佐剂经IN和IM免疫后诱导的抗PcrV和抗PopB血清抗体滴度评估

所有含BECC佐剂的L-PaF/ME配方均能强烈诱导PcrV和PopB特异性血清IgG抗体，IN免疫在第42天多数组达到相当滴度，第56天所有组均达到相当水平。IN免疫还产生显著高于PBS组的PcrV特异性和PopB特异性IgA滴度。IM免疫虽成功诱导PcrV和PopB特异性血清IgG，但未能产生显著高于PBS组的IgA滴度。IgG亚类分析显示，所有BECC佐剂组均具有较高的IgG1和IgG3滴度，IgG1为主要亚类。IN免疫后，L-PaF/ME/BECC438配方最 consistently 实现针对PcrV和PopB的均衡Th2/Th1比率，表明协调的体液和细胞免疫激活。IM免疫则显示系统性偏倚，表现为针对PcrV的轻微Th1偏移和针对PopB的Th2偏移。

### 2. 经IN和IM免疫后血清免疫球蛋白的调理吞噬活性

OPK试验评估疫苗诱导抗体的功能活性。所有L-PaF/ME BECC配方组的OPK活性显著高于PBS组，PBS组显示负杀伤值（表明测定过程中细菌生长）。IN免疫组中，L-PaF/ME/BECC438s产生最高OPK活性，达约70%杀伤率；其次为BECC438b配方，与BECC470s活性相当。IM免疫的所有BECC佐剂L-PaF/ME配方仅产生约50%的OPK活性。血清经热灭活且无外源补体，观察到的杀菌活性主要反映Fc受体介导的调理吞噬摄取和巨噬细胞杀伤，而非补体依赖性杀菌。

### 3. BECC佐剂配方经IN和IM免疫后引发的细胞免疫谱

IN免疫的L-PaF/ME/BECC438b和BECC438s组肺细胞在PcrV和PopB刺激后产生显著更多的IL-17A和IL-2；BECC438b组还显示显著更多的IL-6、TNF-α和IFN-γ。BECC438s在PopB刺激后诱导IL-22显著增加。BECC470b在PcrV和PopB刺激后显著提升IL-17A应答。脾细胞分析显示，BECC438s和BECC438b组在PopB刺激后显著诱导IL-17A，BECC438s组还显示TNF-α诱导。IM免疫主要显示系统性Th1偏倚的细胞因子诱导谱，黏膜印记较少。

### 4. L-PaF/ME配方的BECC438s佐剂经IN免疫较IM递送更有效地增强肺细菌清除

IN免疫组中，BECC438变体显示优越的保护效力。L-PaF/ME/BECC438s免疫小鼠肺载菌量较PBS组显著降低（p<0.0001），BECC438b组也显著降低（p<0.01）。IN免疫的BECC438s组肺中Pa载量减少≥99%，BECC438b组≥97%，BECC470b组约90%，BECC470s组约36%。IM免疫未产生统计学显著的肺载菌量减少。体内保护与体外OPK活性正相关。这些发现强调了黏膜递送（IN）在诱导局部呼吸道免疫（包括IgA应答）中的重要性，而系统免疫（IM）无法一致实现。

### 5. BECC佐剂疫苗配方鉴定出途径依赖性细胞因子动态作为黏膜保护的关键驱动因素

攻击后细胞因子谱分析显示，BECC佐剂疫苗组相对于PBS组未显示显著的细胞因子上调，表明更受调控的促炎应答。PBS组在Pa攻击后经历巨大的、失调的炎症激增（IL-17A ≥ 8 log2，IL-6 ≥ 4 log2，TNF-α ≥ 3 log2倍数变化）。IN免疫的所有BECC配方组仅显示约2 log2倍的细胞因子增加。相关性分析显示，IL-17A的log2倍数变化（攻击前与攻击后未刺激细胞）与体内细菌载量减少之间存在负相关（r = -0.8161，p = 0.0040）。接种组在活菌攻击后表现出受控的细胞因子应答，而PBS组表现出更剧烈的应答，与显著更高的发病率和更大的细菌载量相关。

## 讨论与结论

讨论部分指出，所有配方无论给药途径均诱导了强效IgG应答，但IM免疫后IgA水平显著降低，凸显IN途径在参与黏膜免疫方面的优越能力。有效的Pa疫苗应同时激活黏膜和系统免疫，诱导强效IgG和IgA应答以增强细菌清除。BECC438s配方在所有组中 consistently 显示最高的体内保护效力，这可能与其化学合成产生的高度均一分子结构有关，相比生物来源的BECC438b（含有因发酵过程中天然酶变异产生的次要脂质A同系物），BECC438s与MD-2/TLR4受体复合物的相互作用更一致。IN免疫的优越性与其他呼吸道病原体疫苗研究一致，黏膜递送增强系统IgG和局部IgA应答，促进组织驻留记忆T细胞和IgA分泌浆细胞的募集。IL-17A驱动的Th17免疫对Pa肺部清除至关重要，IN免疫诱导的强效Th1/Th17细胞因子环境可能是攻击后优越肺清除的基础。研究结论为：BECC438，特别是化学合成的BECC438s，在IN免疫后较BECC470提供增强的黏膜和系统免疫，是纳入黏膜下一代Pa疫苗的有前景候选佐剂。该比较分析突显了BECC来源佐剂在IN免疫后改善针对多重耐药病原体（如Pa）疫苗效能的潜力。研究存在局限性，包括未评估长期免疫持久性和针对多样化Pa株的保护力，以及重复给药和潜在黏膜耐受的影响需进一步研究。该论文发表在《Frontiers in Immunology》。