米诺环素通过限制CD4+CD11bc+细胞改善中枢神经系统自身免疫

《Frontiers in Immunology》：Minocycline ameliorates CNS autoimmunity through restraint of CD4+CD11bc+ cells

　　

中文翻译：米诺环素是一种四环素类抗生素，具有显著的抗炎活性，主要针对小胶质细胞和巨噬细胞。核因子E2相关因子2（Nrf2）的激活被认为是米诺环素的重要作用靶点。该药物一直被认为是多发性硬化症（一种中枢神经系统（CNS）自身免疫性疾病）的有前景的治疗药物。然而，其对CNS自身免疫的作用尚未完全阐明。本研究旨在探讨短期米诺环素给药在已充分发展的CNS炎症中的效力。为此，研究人员使用了多发性硬化症的动物模型——实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE），并在疾病高峰期施用米诺环素。该治疗导致EAE临床体征的立即减轻，以及EAE总体临床病程严重程度的降低。米诺环素在EAE高峰期的作用与CNS免疫细胞产生NO和活性氧（ROS）受到抑制相平行。有趣的是，这种降低对CD4⁺CD11bc⁺细胞是特异性的，因为在CD8⁺CD11bc⁺细胞或中性粒细胞中未观察到这种效应。米诺环素在体外有效降低了巨噬细胞中NO和ROS的生成。出乎意料的是，这种效应在从Nrf2基因敲除小鼠获得的巨噬细胞中并未被消除。此外，米诺环素在EAE中的有益作用也在Nrf2基因敲除小鼠中观察到，从而证实了Nrf2激活并非该药物抗脑炎效应的决定性途径的观点。综上所述，这些数据表明米诺环素在EAE中的有益作用主要基于其限制CNS CD4⁺CD11bc⁺细胞产生ROS和NO的能力，且其对EAE的整体效应不依赖于Nrf2。研究结果证实了米诺环素是进一步多发性硬化症相关研究的有效候选药物，并指出CD4⁺CD11bc⁺细胞是CNS自身免疫中重要的致病性髓系细胞群体。

论文解读

**一、研究背景与目的**

多发性硬化症（multiple sclerosis, MS）是一种中枢神经系统（central nervous system, CNS）的慢性自身免疫性疾病，其病理特征包括炎症性脱髓鞘和轴突损伤。在MS的发病机制中，巨噬细胞和小胶质细胞作为主要的效应细胞，通过产生大量的活性氧（reactive oxygen species, ROS）、一氧化氮（nitric oxide, NO）和炎症细胞因子，在CNS自身免疫的慢性阶段发挥关键作用。米诺环素（minocycline）作为第二代四环素类抗生素，因其显著的抗炎活性而被认为是治疗MS的有前景的药物。既往研究表明，米诺环素的主要细胞靶点是小胶质细胞和巨噬细胞，能够有效抑制其产生ROS、NO和促炎细胞因子。然而，米诺环素对CNS自身免疫的作用机制尚未完全阐明，特别是其与核因子E2相关因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2, Nrf2）通路的关系仍存在争议。目前尚缺乏在神经炎症背景下，尤其是在实验性自身免疫性脑脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE）模型中，直接研究Nrf2在米诺环素对巨噬细胞/小胶质细胞作用中的角色。因此，本研究旨在填补这一知识空白，探讨米诺环素在充分发展的CNS炎症中的治疗潜力，并阐明Nrf2在其抗脑炎效应中的作用。

**二、主要技术方法**

研究人员使用了多种实验技术开展这项研究。动物模型方面，研究使用了Dark Agouti（DA）大鼠和C57BL/6小鼠，以及Nrf2基因敲除（Nrf2^-/-）小鼠。EAE模型通过脊髓匀浆（spinal cord homogenate, SCH）免疫DA大鼠或髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（myelin oligodendrocyte glycoprotein, MOG）35-55肽段免疫C57BL/6小鼠诱导。药物处理采用腹腔注射米诺环素（50 mg/kg），在疾病高峰期（免疫后第11-14天，大鼠模型）或出现首发临床体征时（免疫后第12-28天，小鼠模型）给药。细胞实验使用了BV2小鼠小胶质细胞系和从小鼠腹腔获得原代巨噬细胞。功能检测方面，采用DAF-FM染色结合流式细胞术检测NO产生，采用DHR或H2DCF染色检测ROS生成，通过晶体紫（crystal violet, CV）实验评估细胞活力。基因表达分析采用逆转录-实时聚合酶链反应（RT-qPCR）检测Nrf2下游调控基因（Gclc、Gclm、Gsr、Hmox1、Nqo1）和炎症因子（Il6、Tnf）的表达。流式细胞术用于鉴定和定量CNS中各免疫细胞亚群，包括CD4⁺CD11bc⁺细胞和CD8⁺CD11bc⁺细胞。

**三、主要研究结果**

3.1 米诺环素下调EAE临床严重程度

在DA大鼠EAE模型中，从疾病高峰期（临床评分2.7±0.4）开始给予米诺环素治疗，能够立即减轻EAE症状，并产生持续的临床改善效果。重要的是，米诺环素治疗显著改变了临床形式的分布，将重症形式转变为中度形式。相比之下，另一种第二代四环素类药物多西环素（doxocycline）以相同方式给药却对EAE临床病程无影响，表明米诺环素的抗脑炎效应并非第二代四环素类药物的通用特性。细胞分析显示，米诺环素治疗显著减少了CNS中的免疫细胞总数，其中CD45^highCD11bc⁺细胞和中性粒细胞的比例降低，而CD4⁺T细胞比例相对增加，提示米诺环素在炎症CNS组织中诱导了免疫调节性转变。

3.2 米诺环素抑制EAE中NO和ROS的生成

在米诺环素治疗后的EAE大鼠脊髓免疫细胞中，自发性NO产生显著降低。ROS产生（无论是自发性还是PMA刺激后）也在米诺环素处理组中下调。进一步分析发现，NO和ROS产生的降低特异性地见于CD4⁺CD11bc⁺细胞，而在CD8⁺CD11bc⁺细胞中未观察到显著变化。使用NADPH氧化酶抑制剂acetovanillone处理后，CD4⁺CD11bc⁺细胞中的DHR信号降低，表明NADPH氧化酶至少部分地参与了该细胞群体中ROS的产生。

3.3 脑内CD4⁺CD11bc⁺细胞的丰度与EAE严重程度相关

在EAE晚期（免疫后第24-28天），研究人员比较了中度和重度EAE大鼠脑内不同结构（脑桥、小脑、海马和皮层）中CD4⁺CD11bc⁺细胞的分布。结果显示，重度EAE大鼠在所有检测的脑结构（除脑桥外）中CD4⁺CD11bc⁺细胞的数量均显著增加，而CD8⁺CD11bc⁺细胞的增加仅见于小脑。在脊髓中也观察到重度EAE大鼠CD4⁺CD11bc⁺细胞数量的显著增加。这些结果表明CD4⁺CD11bc⁺细胞在CNS中的浸润与EAE严重程度密切相关。

3.4 米诺环素以Nrf2非依赖方式抑制NO和ROS的生成并改善EAE

体外实验证实，米诺环素在无毒浓度下能有效抑制BV2小胶质细胞和原代腹腔巨噬细胞中NO和ROS的产生。米诺环素处理BV2细胞后，Nrf2下游调控基因（Gclc、Gclm、Gsr、Hmox1和Nqo1）的表达水平显著上调，证实米诺环素能够激活Nrf2通路。然而，在从Nrf2^-/-小鼠获得的巨噬细胞中，米诺环素仍能有效抑制NO和ROS的产生，表明其抗氧化效应不依赖于Nrf2。值得注意的是，米诺环素对Il6和Tnf表达的抑制作用仅在WT巨噬细胞中观察到，而在Nrf2^-/-巨噬细胞中未观察到，提示米诺环素对促炎细胞因子表达的调节可能依赖于Nrf2。在体内实验中，尽管Nrf2^-/-小鼠免疫后表现出比WT小鼠更严重的EAE，但米诺环素在两种基因型小鼠中均能同样有效地改善EAE，进一步证实了Nrf2激活并非米诺环素抗脑炎效应的必要条件。

**四、讨论与结论**

本研究首次证明，在EAE高峰期给予短期米诺环素治疗能够有效对抗已充分发展的CNS炎症。这一发现具有重要的临床转化意义，因为其模拟了MS患者出现严重神经功能缺损时的治疗场景。米诺环素与多西环素在抗EAE效应上的差异可能源于米诺环素更容易穿过血脑屏障的特性。研究结果明确表明，CNS CD4⁺CD11bc⁺细胞（包含小胶质细胞和巨噬细胞）是米诺环素在EAE CNS中的主要靶细胞群体，该细胞群体的活性对EAE临床结局具有显著影响。通过限制CD4⁺CD11bc⁺细胞产生ROS和NO的能力，米诺环素能够有效减轻CNS自身免疫的严重程度。该研究结果证实了米诺环素是一种有效的免疫调节剂，对CNS自身免疫具有重要价值，并提示CD4⁺CD11bc⁺细胞是MS发病中的重要致病性髓系细胞群体，为其作为MS治疗靶点提供了实验依据。

结论部分指出，米诺环素是有效的免疫调节剂，对CNS自身免疫具有重要价值。研究结果确定了CNS CD4⁺CD11bc⁺细胞是大鼠EAE中米诺环素的作用靶点。虽然已知人类巨噬细胞/小胶质细胞表达CD4，但尚缺乏关于人类MS背景下CD4⁺CD11bc⁺ CNS细胞的研究。因此，迫切需要在MS患者的脑病变和/或脑脊液中鉴定CD4⁺CD11bc⁺细胞，并对其进行基因组和蛋白质组学特征分析及功能测试，以深入理解该细胞群体在MS发病机制中的作用及米诺环素的治疗潜力。