D(+)-生物素偶联的间苯二酚二苄基醚类肿瘤靶向PD-L1抑制剂用于精准癌症免疫治疗的理性设计

《Frontiers in Immunology》：Rational design of D(+)-biotin-conjugated resorcinol dibenzyl ethers as tumor-targeted PD-L1 inhibitors for precision cancer immunotherapy

　　

**摘要**

**目标：** 本研究旨在发现并表征新型D(+)-生物素偶联的PD-L1抑制剂，用于精准肿瘤靶向的癌症免疫治疗。

**方法：** 本研究采用了整合策略，包括计算机辅助分子模拟、抗增殖活性（CCK8）测定、表面等离子体共振（SPR）、药代动力学评估以及体内抗肿瘤疗效评价。

**结果：** 化合物SW-1对PD-1/PD-L1相互作用表现出强效且选择性的抑制活性，其半数抑制浓度（IC₅₀）为5.6 nM，并且对人源和鼠源PD-L1均具有高结合亲和力。分子对接和分子动力学模拟证实了SW-1与PD-L1二聚体界面稳定结合，并存在关键的分子间相互作用。在大鼠中的药代动力学研究表明，该化合物具有良好的系统暴露量和适合体内应用的半衰期。在B16-F10黑色素瘤小鼠模型中，SW-1实现了比PD-L1抗体（肿瘤生长抑制率TGI = 44.2%）更强的肿瘤生长抑制效果（TGI = 64.9%），有效促进了CD8⁺ T细胞向肿瘤微环境的浸润，并保持了良好的体内安全性，未观察到明显的体重减轻。

**结论：** SW-1作为一种高效的生物素偶联PD-L1小分子抑制剂，表现出卓越的靶点活性、良好的药代动力学特性、强效的抗肿瘤疗效和高安全性。这些结果凸显了SW-1作为精准肿瘤靶向免疫治疗进一步开发的有前景的先导化合物。

**论文解读：基于D(+)-生物素偶联策略的肿瘤靶向PD-L1小分子抑制剂SW-1的理性设计、生物活性评估及免疫治疗潜力**

**一、 研究背景与科学问题**

靶向程序性死亡受体1（PD-1）/程序性死亡配体1（PD-L1）免疫检查点轴已成为现代抗肿瘤药物发现和癌症免疫治疗中最关键且发展迅速的领域之一。基于单克隆抗体（mAb）的PD-1/PD-L1抑制剂已在多种实体瘤中取得显著的临床里程碑，然而其广泛的治疗适用性仍受到固有理性和安全性限制的制约，包括过度延长的全身暴露（半衰期常超过2-3周）、适中的客观缓解率（在未选择人群中通常为15-25%），以及显著的免疫相关不良事件（irAEs）发生。具有临床重要性的irAEs包括免疫介导的结肠炎，以及更为关键的检查点抑制剂相关性心肌炎——一种罕见但常致命的并发症，严重影响患者安全、治疗连续性和长期生存前景。此外，PD-L1不仅在肿瘤细胞上组成性表达，还在多种正常组织中表达，包括淋巴区室和重要非淋巴器官。系统性、非选择性的PD-L1阻断不可避免地破坏外周免疫稳态，导致针对自身抗原的异常T细胞活化，这一机制直接涉及irAEs的发生、谱系和严重程度。因此，对于设计用于肿瘤选择性递送的PD-L1抑制剂，存在关键的未满足医疗需求，该抑制剂能够在健康组织中保留生理性PD-L1功能，同时在肿瘤微环境内有效抑制其免疫抑制活性。

已有积累的证据表明，生物素受体，特别是钠依赖性多维生素转运体（SMVT），在多种恶性肿瘤中显著过表达。D(+)-生物素作为SMVT的高亲和力内源性配体，已被广泛验证为一种稳健的肿瘤归巢部分。将生物活性骨架与D(+)-生物素偶联可促进受体介导的摄取和瘤内积累，显著减少脱靶分布和相关毒性。新兴的机制研究进一步揭示，生物素本身可调节树突状细胞成熟，增强CD8⁺ T细胞浸润和细胞毒功能，表明其具有与PD-L1阻断协同作用的内在免疫刺激特性。研究人员此前基于构效关系（SAR）研究，已鉴定出间苯二酚二苄基醚衍生物作为一种优势骨架，具有强效PD-L1结合亲和力、稳健的PD-1/PD-L1蛋白-蛋白相互作用破坏能力以及在同系小鼠模型中的显著抗肿瘤功效。基于D(+)-生物素的双重功能——既作为经过验证的肿瘤选择性递送载体，又作为内源性免疫调节剂，研究人员提出了一种理性的分子杂交策略，以设计并合成新型D(+)-生物素偶联的间苯二酚二苄基醚抑制剂，旨在同时解决疗效、选择性和安全性瓶颈。

**二、 主要关键技术方法**

1. **计算机辅助分子模拟：** 利用AutoDock Vina进行分子对接，构建蛋白质-配体复合物；使用GROMACS 2019软件结合CHARMM36力场进行100 ns的分子动力学（MD）模拟，并通过MM/PBSA方法估算结合自由能。
2. **体外活性筛选：** 采用CCK-8法评估目标化合物对B16-F10、HepG2和LO2细胞系的抗增殖活性；使用均相时间分辨荧光（HTRF）方法检测化合物对PD-1/PD-L1相互作用的抑制活性（IC₅₀）。
3. **表面等离子体共振（SPR）分析：** 使用PlexArray HT系统，将人PD-L1（hPD-L1）和鼠PD-L1（mPD-L1）共价固定于传感器芯片上，测定化合物SW-1与两者的平衡解离常数（K_D）。
4. **药代动力学（PK）研究：** 在雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠中，分别通过静脉注射（i.v.，2 mg/kg）、腹腔注射（i.p.，5 mg/kg）和口服灌胃（p.o.，40 mg/kg）给予SW-1，采用LC-MS/MS系统测定血浆药物浓度并计算药代动力学参数。
5. **体内抗肿瘤疗效评价：** 在B16-F10黑色素瘤同系小鼠模型中，通过腹腔注射给予SW-1（每日一次，持续15天），并以抗小鼠PD-L1抗体（10 mg/kg，每三天一次）作为参考对照，评估肿瘤生长抑制率（TGI）和安全性。
6. **免疫微环境分析：** 通过免疫荧光（IF）染色检测肿瘤组织中CD8⁺ T细胞的浸润；使用酶联免疫吸附测定（ELISA）定量肿瘤组织中干扰素-γ（IFN-γ）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-2（IL-2）的水平。

**三、 研究结果**

**3.1 合理设计**

为开发具有改善类药物性质的双功能肿瘤靶向PD-L1抑制剂，研究人员采用了基于结构的合理设计策略。鉴于先前构建的直接连接生物素部分与间苯二酚二苄基醚PD-L1抑制剂核心的双功能偶联物存在分子量较高、取代模式复杂、理化性质欠佳等挑战，该研究实施了骨架跳跃（scaffold-hopping）策略，重新设计PD-L1抑制模块，在保留与PD-L1关键相互作用的同时降低分子量。优化后的抑制剂核心采用简化的联苯稠合苯并噁嗪骨架，保留了疏水联苯基序和氢键供体/受体等关键药效团。随后，将作为肿瘤靶向模块的生物素部分偶联至重新设计的PD-L1抑制核心，从而获得具有PD-L1抑制、肿瘤特异性靶向和改善类药物性质的双功能分子。

**3.2 化学合成**

目标化合物SW1-7的合成路线始于市售的2,6-二溴甲苯，其与2-氨基芳基硼酸衍生物发生Suzuki偶联反应得到联芳基中间体A3。中间体A3随后与生物素衍生物A4在HATU和DIPEA存在下进行酰胺缩合反应得到酰胺产物A5。接着，A5与来自2-溴-3-甲氧基苯甲醛的硼酸酯发生第二次Suzuki偶联反应，得到醛中间体A7。最后，目标化合物SW1-7通过在乙酸中存在氰基硼氢化钠（NaBH₃CN）的条件下，醛中间体A7与胺衍生物A8进行还原胺化反应获得。所有化合物的结构均通过核磁共振氢谱（1H NMR）确认，并以碳谱（13C NMR）、高分辨质谱（HRMS）和高效液相色谱（HPLC）进行补充表征，证实结构完整性和不低于95%的化学纯度。

**3.3 生物素偶联的肿瘤靶向PD-L1小分子抑制剂显示出强效的靶点和细胞抑制活性**

通过系统地改变生物素化尾部和芳香药效团的结构变异，研究人员建立了构效关系（SAR）。核心联苯PD-L1结合基序在所有类似物中保守，赋予了一致的纳摩尔级PD-L1抑制活性。化合物SW-1作为先导化合物脱颖而出，其PD-L1抑制IC₅₀为5.6 ± 0.3 nM，显著优于未偶联生物素的核心抑制剂BMS-202（IC₅₀ = 61 ± 2.0 nM）。SW-1对B16-F10细胞显示强效抗增殖活性（IC₅₀ = 0.5 ± 0.1 μM），同时对正常LO2细胞无毒性（IC₅₀ > 20 μM），显示出超过40倍的治疗窗口。构效关系分析表明，小体积、不带电荷或弱极性的取代基（如SW-1中的伯酰胺）是维持高PD-L1亲和力的最佳选择；而较大的环状取代基则显著削弱结合能力。此外，PD-L1抑制效价与细胞活性之间存在明确相关性。

**3.4 SW-1与PD-L1的分子建模和分子动力学模拟**

为阐明SW-1与PD-L1的分子结合模式，研究人员使用PD-L1晶体结构（PDB ID: 5J89）进行了分子对接。对接分析显示，SW-1深深插入PD-L1二聚体界面的疏水口袋中，其联苯片段与来自两条PD-L1链的残基形成强π-π堆积相互作用，同时生物素部分与PD-L1骨架或侧链残基形成多个氢键。100 ns的分子动力学（MD）模拟证实了复合物的高结构稳定性：PD-L1二聚体的均方根偏差（RMSD）值稳定，SW-1快速平衡并波动于狭窄范围内；模拟过程中持续维持1-2个氢键；回旋半径（Rg）分布狭窄，表明蛋白质整体折叠和紧实度保持完好；范德华（LJ）和静电（Coul）能量协同贡献于结合，总相互作用能始终保持高度负值。结合自由能计算（MM/PBSA）和逐残基能量分解进一步鉴定了贡献主导能量的关键残基。这些计算分析为SW-1在生化测定中观察到的强效PD-L1抑制活性提供了可靠的结构和动力学证据。

**3.5 SW-1对人和鼠PD-L1表现出强效结合亲和力**

通过表面等离子体共振（SPR）技术，研究人员直接定量了SW-1对人和鼠PD-L1的结合亲和力。SPR传感图显示，SW-1对两种直系同源物均具有明确的、浓度依赖性结合，在所测浓度范围（0.01–1 μM）内呈现快速结合和解离缓慢的动力学特征。稳态响应拟合得出SW-1与人PD-L1结合的平衡解离常数（K_D）为13.1 nM，与鼠PD-L1结合的K_D为18.3 nM。该结果表明SW-1能以高亲和力结合PD-L1直系同源物，在免疫活性小鼠模型中验证了其药理学相关性。

**3.6 体内药代动力学研究**

在雄性SD大鼠中分别通过静脉注射（i.v.，2 mg/kg）、腹腔注射（i.p.，5 mg/kg）和口服灌胃（p.o.，40 mg/kg）给予SW-1后，研究人员表征了其药代动力学（PK）特征。静脉注射后，SW-1表现出良好的系统暴露量（AUC_(0–∞) = 1069.6 ± 116.8 ng/mL·h），中等分布容积（V_z = 17.6 ± 3.2 L/kg）和终末消除半衰期（t_1/2 = 6.4 ± 0.5 h），清除率低（CL = 1.8 ± 0.2 L/h/kg）。腹腔注射后吸收迅速（T_max = 0.25 h），系统暴露量高（AUC_(0–∞) = 1377.7 ± 156.1 ng/mL·h），相对静脉给药的绝对生物利用度约为51.6%。口服给药则导致生物利用度有限（C_max = 95.1 ± 25.9 ng/mL，AUC_(0–∞) = 654.1 ± 82.7 ng/mL·h），较高的清除率和分布容积提示显著的首次效应或较差的胃肠道吸收。基于这些数据，研究人员选择腹腔注射作为后续体内疗效研究的优选给药途径。

**3.7 SW-1在B16-F10小鼠模型中的体内疗效**

在B16-F10黑色素瘤同系小鼠模型中评估了SW-1的体内抗肿瘤功效。与对照组相比，SW-1和PD-L1抗体均显著降低了肿瘤重量，且SW-1显示出更优的疗效。SW-1的肿瘤生长抑制率（TGI）为64.9%，而PD-L1抗体组的TGI值为44.2%。SW-1治疗在整个研究过程中耐受性良好，所有组小鼠体重稳定，无显著毒性，且未影响动物存活率。免疫荧光分析显示，与对照组和PD-L1抗体组相比，SW-1治疗组肿瘤实质内CD8⁺ T细胞密度显著增加。ELISA定量显示，SW-1治疗组肿瘤组织中IFN-γ水平从对照组的85.7 ± 7.3 pg/mL显著升高至178.1 ± 13.5 pg/mL，而TNF-α和IL-2水平仅呈现无统计学意义的轻微上升趋势。此外，血清心肌损伤生物标志物（α-HBDH、AST、LDH、CK-MB和CK）检测显示，游离PD-L1抗体组的心肌酶水平升高，特别是CK达到961 U/L，而SW-1治疗组的心肌生物标志物水平与对照组几乎一致，表明生物素修饰的SW-1有效避免了系统性外周免疫细胞的过度激活，显著降低了irAEs风险。

**四、 讨论与结论**

讨论部分指出，第一代免疫检查点抑制剂，特别是靶向PD-1/PD-L1通路的单克隆抗体，虽已革新癌症免疫治疗，但其临床疗效仍受限于客观缓解率低、原发性和获得性耐药以及无法在“冷”肿瘤微环境中充分激活抗肿瘤免疫。与化疗、靶向治疗或其他免疫调节剂的联合方案虽显示出协同活性，但联合用药引入了重叠毒性、药代动力学不一致、肿瘤分布不协调和不可预测的药物相互作用等挑战。在此背景下，生物素偶联的PD-L1抑制剂SW-1成为一种特别有前景的策略，通过利用多种肿瘤细胞上生物素转运体SMVT的高表达，实现肿瘤靶向递送，减少系统暴露和脱靶效应，同时提高肿瘤部位的局部药物浓度。研究证实，SW-1通过SMVT介导的生物素转运在肿瘤中积累，提升瘤内CD8⁺ T细胞浸润和IFN-γ分泌，从而重塑免疫抑制性的“冷”肿瘤。生物素部分不仅作为靶向配体，还改善了分子的整体理化性质和药代动力学行为。

研究结论为：研究人员通过计算机辅助药物设计（CADD）策略合理设计了生物素偶联的小分子PD-L1抑制剂SW-1。SW-1以5.6 ± 0.3 nM的IC₅₀强效阻断PD-1/PD-L1相互作用，并以高亲和力结合人和鼠PD-L1。在B16-F10同系黑色素瘤小鼠中，SW-1实现了64.9%的肿瘤生长抑制且无系统毒性，远优于PD-L1抗体单药治疗。机制上，SW-1通过SMVT介导的生物素转运在肿瘤中积累，提升瘤内CD8⁺ T细胞浸润和IFN-γ分泌，从而重塑免疫抑制性冷肿瘤。这种双功能骨架克服了抗体和传统小分子PD-L1药物的主要缺点，SW-1可作为后续靶向肿瘤免疫治疗临床前优化的高效力、肿瘤选择性先导候选化合物。该研究成果发表于《Frontiers in Immunology》。