英格兰国王理查三世的口腔微生物组

《American Journal of Biological Anthropology》：The Oral Microbiome of King Richard III of England

　　

**摘要**

**目的**：对古代牙结石的宏基因组学研究可为口腔健康、疾病和饮食提供见解。本文分析了英格兰国王理查三世（1452–1485年）的牙结石宏基因组。

**材料与方法**：从理查三世的三颗牙齿中提取牙结石DNA，并进行了深度近4亿条读长的鸟枪法测序。对宏基因组数据进行分类学分析，并与来自英格兰、爱尔兰、荷兰和德国的新测及先前已发表的、跨越新石器时代至今的牙结石宏基因组进行比较。对测序数据进行从头组装，并对归属于坦纳氏菌属（Tannerella）的宏基因组组装基因组（MAGs）进行系统发育相关性和毒力研究。对推定的饮食DNA进行了真实性评估。

**结果**：理查三世牙结石保存完好，并产生了异常高量的DNA。口腔微生物组物种多样性落在先前在其他北欧人群中观察到的范围内，表明皇室生活方式和丰富饮食并未显著影响其口腔微生物群。重建的坦纳氏菌基因组含有当今口腔坦纳氏菌物种中发现的多种毒力因子。未发现可确认的推定饮食DNA。

**讨论**：理查三世牙结石产生了迄今发表的最丰富的古代口腔宏基因组之一，但其物种多样性与过去7000年间生活在北欧的平民并无区别。由于未能回收到足够的植物和动物DNA来研究饮食，这表明即使保存异常完好的牙结石，可能也不足以作为饮食DNA的来源。

**论文解读：英格兰国王理查三世口腔微生物组的宏基因组学研究**

**一、研究背景与科学问题**

2012年，英国莱斯特大学考古团队在former Grey Friars教堂遗址停车场下方发现了英格兰国王理查三世（1452–1485年）的遗骸，随后通过骨学分析、线粒体基因组测序及同位素分析等多重证据确认了其身份。理查三世是英国历史上极具争议性的中世纪君主，其短暂而动荡的统治期恰逢玫瑰战争（1455–1487年）。此前的同位素分析表明，他在统治后期摄入了大量高营养级食物（如鱼类、水禽和葡萄酒），反映了典型的贵族奢侈饮食特征。

牙结石是矿化的牙菌斑生物膜，在个体生命期间逐层形成，能够长期封存口腔微生物群落及食物生物分子，因此被视为口腔微生物组的长期生物分子档案。然而，此前发表的大部分古代牙结石宏基因组数据来自社会地位较低或地位不明的个体，针对高社会地位个体的口腔微生物组研究极为缺乏。此外，饮食是否影响口腔微生物群落结构至今缺乏明确证据，而从牙结石中鉴定并验证饮食来源DNA也面临诸多方法论挑战。坦纳氏菌属（Tannerella）中的福赛斯坦纳氏菌（Tannerella forsythia）是牙周病的重要病原体，其在古代牙结石中高度丰富，但该物种的进化历史——特别是毒力因子的获得时间——仍是悬而未决的科学问题。

理查三世遗骸优异的生物分子保存状态为其牙结石宏基因组研究提供了独特契机。本研究旨在通过深度测序和宏基因组分析，阐明这位中世纪国王的口腔微生物组组成、与北欧普通人群的比较差异、坦纳氏菌属的系统发育与毒力特征，并探索牙结石中饮食DNA的可回收性。

**二、关键技术方法**

研究人员从理查三世三颗牙齿（左下第一前磨牙R31、左上尖牙R32、右下第一前磨牙R33）的舌面采集牙结石样本，其中尖牙样本被分为两个亚组分，共计4份样本。DNA提取在俄克拉荷马大学分子人类学与微生物组研究实验室（LMAMR）的专用古DNA洁净室中完成，采用Dabney等（2013）建立的古DNA提取方案并加以改良。另选取来自德国斯图加特-穆尔豪森新石器时代遗址（LBK文化，公元前6千年）的3例样本及德国达尔海姆中世纪修道院遗址个体G12的样本作为对比。测序策略上，理查三世样本在耶鲁基因组分析中心（YCGA）采用Illumina HiSeq 2000平台进行双端100 bp测序，共生成393,365,842条读长；新石器时代样本在马克斯·普朗克进化人类学研究所分别采用NextSeq 500和HiSeq 4000平台测序。数据分析流程包括：利用nf-core/eager v2.4.4流程进行读长处理与人类基因组比对去除；采用Kraken2联合GTDB v202数据库进行分类学分析；运用SourceTracker和cuperdec进行微生物保存状态评估；通过MALT比对NCBI nt数据库进行饮食DNA筛查；利用MEGAHIT、metaBAT、MaxBin和CONCOCT等工具进行宏基因组从头组装与分箱，获得宏基因组组装基因组（MAGs）；采用PhyloPhlAn和RAxML-NG构建坦纳氏菌属系统发育树；以DamageProfiler评估古DNA损伤模式验证序列真实性。

**三、研究结果**

**3.1 理查三世牙结石的异常DNA回收**

理查三世牙结石的DNA提取产率为122.4至506.7 ng/mg，与此前测定的143例考古牙结石样本（中位数36 ng/mg，范围0.1–437 ng/mg）相比位居最高之列，与欧洲北部（达尔海姆、蒂克希尔、米登贝姆斯特）和大洋洲（拉帕努伊）保存极佳的考古遗址相当，甚至接近现代牙结石的水平（83.4–346 ng/mg）。这一结果表明其牙结石DNA保存状态极为优异，支持进行深度测序和从头基因组组装。

**3.2 保存完好的口腔微生物群但未确认饮食DNA**

SourceTracker分析显示理查三世、斯图加特-穆尔豪森和达尔海姆样本中超过90%的DNA序列可归因于口腔来源，cuperdec分析也证实了这些样本及对比数据集中口腔类群的高比例，表明样本保存状态优异且污染极少。然而，理查三世牙结石中未发现任何可确认的饮食DNA序列。经MALT分类鉴定，未检测到植物序列；非人动物序列仅鉴定出鲤鱼（Cyprinus carpio，4112条读长）和欧洲刺猬（Erinaceus europaeus，42,683条读长）两个物种，而这二者已知具有污染且不可靠的参考基因组，且在阴性和环境对照中同样存在，故判定为假阳性。

**3.3 口腔微生物组多样性分析**

在理查三世牙结石中共鉴定出近400个微生物物种，与英格兰、爱尔兰、荷兰和德国其他保存良好的考古牙结石样本中检测到的物种数相近。Shannon指数（物种均匀度指标）在各牙结石数据集中表现相似。样本间多样性主成分分析（PCA）显示理查三世牙结石位于北欧已知微生物多样性范围之内，表明其口腔微生物群落结构与同一地理区域和时期其他个体的差异不显著。丰度最高的30个物种中，有9个为公认的口腔类群，包括与牙周病相关的物种如脱硫球形菌（Desulfobulbus oralis）、福赛斯坦纳氏菌（Tannerella forsythia）、隐秘梭杆菌（Fretibacterium fastidiosum）、阿洛西斯丝杆菌（Filifactor alocis）和牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis），与理查三世全口牙列观察到的广泛性牙周炎相符。不同牙齿间的物种丰度存在差异：右下第一前磨牙（R33）中脱硫球形菌、放线菌属物种等丰度较高；左下第一前磨牙（R31）中奇异劳特罗普菌（Lautropia mirabilis）、马氏棒杆菌（Corynebacterium matruchotii）等丰度较高；左上尖牙（R32A和R32B）中福赛斯坦纳氏菌、隐秘梭杆菌等丰度较高。

**3.4 福赛斯坦纳氏菌的系统发育与毒力因子多样性**

通过从头组装和分箱，研究人员从理查三世样本中获得了1个福赛斯坦纳氏菌基因组，从英格兰拉德克利夫医院样本中获得4个，从荷兰米登贝姆斯特样本中获得3个；另从拉德克利夫医院和德国斯图加特-穆尔豪森样本中各获得1个候选坦纳氏菌隐秘菌（Candidatus Tannerella abscondita）基因组，从德国达尔海姆样本中获得1个候选坦纳氏菌蛇形菌（Candidatus Tannerella colubrina）基因组。所有14个坦纳氏菌基因组均满足中高质量MAGs的最低阈值标准。古DNA损伤模式分析确认了这些基因组的古代来源，其中理查三世和拉德克利夫医院样本表现出预期的年龄相关损伤模式。系统发育分析（基于PhyloPhlAn标记基因树）显示理查三世、英格兰和荷兰的古代福赛斯坦纳氏菌基因组与大多数现代参考基因组聚在同一进化枝内，代表真正的福赛斯坦纳氏菌物种。两株分离自犬类的参考基因组位于主枝之外，代表独立物种。来自英格兰和新石器时代德国的两株基因组位于福赛斯坦纳氏菌主枝基部，被确认属于新近描述的候选种钙化坦纳氏菌隐秘菌。遗传距离计算支持这些归属判定：福赛斯坦纳氏菌进化枝内的成对距离为0.053，接近物种水平划分阈值（0.05）。毒力因子分析显示，福赛斯坦纳氏菌基因组中鉴定的8种已知毒力因子（包括表面层（S-layer）糖蛋白基因tfsA和tfsB）在理查三世基因组中均有发现——理查三世基因组是唯一同时包含tfsA和tfsB两个基因的重建MAG，这可能与其最高的基因组完整度有关。部分重建基因组中未能检测到某些毒力因子基因，可能与基因组完整度较低有关而非真实缺失。

**四、讨论与结论**

本研究表明，理查三世牙结石的DNA保存状态异常优异，产生了迄今发表的最丰富的古代口腔宏基因组之一，但其口腔微生物组物种多样性与过去7000年间北欧普通人群并无显著差异，表明皇室生活方式和丰富饮食并未对口腔微生物群落结构产生可检测的影响。饮食DNA的缺乏提示，牙结石中饮食DNA的掺入和保存可能极为有限，即使保存异常完好并深度测序，牙结石也可能不足以作为饮食DNA的来源。坦纳氏菌属的系统发育分析揭示了该菌属在个体内部甚至单一牙面上的多样性，表明坦纳氏菌属的多样性可能高于此前基于参考基因组比对方法所认识的水平。该研究凸显了从古代牙结石从头组装宏基因组以阐明口腔微生物多样性及遗传变异的优势，为理解宿主相关微生物的进化历史、社会地位对口腔健康的影响以及古代DNA研究的方法学局限性提供了重要参考。该研究发表于《American Journal of Biological Anthropology》。