利用离心场流分离法结合多角度光散射技术确定纳米粒子的密度分布曲线

《Journal of Chromatography A》：Determination of nanoparticle density profiles using centrifugal field-flow fractionation coupled with multi-angle light scattering

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  使用CFFF结合MALS进行连续纳米粒子密度分析。
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  在天然溶液条件下确定有效粒子密度。
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  密度分析揭示了超出粒子尺寸测量的异质性。
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  该方法使用脂质体、磷脂体和慢病毒颗粒进行了验证。
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  密度为纳米粒子表征提供了补充参数。

引言

纳米粒子群体的可靠表征仍然是一个主要的分析挑战，因为纳米粒子在尺寸、组成和内部结构上往往存在异质性。尽管经常使用动态光散射（DLS）、电子显微镜和光散射技术来测量粒子尺寸，但由于粒子组成、浮力和质量-体积关系的重要性，粒子密度却很少通过实验来确定。[1]

动态光散射（DLS）可以提供粒子的流体力学尺寸，但并不能直接测定粒子密度。多角度光散射（MALS）通常与分离方法结合使用，可以提供与粒子和质量相关的信息；然而，定量解释通常需要对粒子组成和光学性质进行假设。不对称流场流式分离（AF4）结合MALS已成为纳米粒子表征的重要平台，而最近将AF4与紫外光散射、折射率测量和小角X射线散射（SAXS）检测相结合的技术进一步扩展了分离过程中可获得的结构信息。[[2], [3], [4]] 补充技术如密度匹配分析离心（AUC）和冷冻电子显微镜（cryo-EM）可以提供关于浮力和内部形态的额外信息。[[5], [6], [7]] 尽管有了这些进展，但这些方法都无法在天然溶液条件下连续测定分离后的纳米粒子群体的有效密度。

尽管这些技术提供了关于粒子尺寸、形态和内部结构的宝贵信息，但有效粒子密度通常只能通过间接方法或补充测量获得。因此，在解释粒子质量、浮力或内部结构时，常常需要假设粒子密度。这些局限性促使人们开发出能够在溶液条件下确定异质纳米粒子群体有效密度的分析方法。最近的研究重新应用了离心场流式分离技术来表征异质纳米粒子系统。Yamamoto等人[8]将离心场流式分离应用于脂质体和脂质纳米颗粒的物理化学特性分析，证明了CF3保留行为对粒子尺寸和药物负载的敏感性，并强调了粒子密度作为一个重要的物理化学属性。Tsuchiya等人[9]进一步展示了CF3能够分辨出常规动态光散射难以检测到的轻微纳米粒子聚集现象。这些研究说明了离心场流式分离对纳米粒子质量和物理化学状态差异的敏感性，支持其在异质纳米粒子群体表征中的应用。

最近有一项研究使用CFFFF结合离线透射电子显微镜（TEM）确定了二氧化硅纳米颗粒的表观密度和孔隙率。[10]在这种方法中，CFFFF提供有效粒子质量，而几何粒子体积则通过收集的组分进行TEM分析独立确定。TEM的使用可以直接测量粒子尺寸和形态，但需要收集组分并进行离线粒子成像，因此密度是针对选定组分计算的。相比之下，将CFFFF直接与MALS结合使用可以在分离过程中在线获得粒子尺寸信息，从而无需收集组分即可连续评估有效粒子密度。因此，CFFFF–MALS方法能够在异质群体中实现连续的密度分析，并且适用于溶液条件，尽管计算出的粒子体积取决于测得的回转半径与假设的粒子几何形状和质量分布之间的关系。

离心场流式分离（CFFF）根据有效质量在施加的离心场中分离粒子，[11,12]而多角度光散射（MALS）可以连续提供洗脱曲线上的回转半径（Rg）。这两种互补的测量方法使得能够连续测定保留的纳米粒子群体的有效密度。

本研究的目的是将连续在线密度分析作为CFFFF–MALS的分析能力。该方法应用于脂质体、磷脂体和慢病毒颗粒，这些颗粒代表了工程化的、负载蛋白质的和天然的纳米粒子系统。通过比较得到的密度曲线，可以看出基于质量的分离方法揭示了仅通过粒子尺寸无法发现的结构和组成异质性，从而为纳米粒子表征提供了补充信息。

章节摘录

粒子质量和密度测定理论

场流式分离（FFF）在层流条件下通过狭窄的带状通道分离粒子，分离场垂直于流动方向施加。施加的场使粒子朝积累壁移动，而扩散则抵消这种迁移，从而在通道厚度上形成平衡浓度分布。

在离心场流式分离（CFFF）中，施加的场是离心加速度，粒子保留情况由...

材料

脂质体和磷脂体样品由Michael Valic（加拿大多伦多大学健康网络的Porphysome Foundry提供）。慢病毒颗粒购自GeneCopoeia（美国马里兰州Rockville）。除非另有说明，所有试剂均按接收时的状态使用。

样品制备

脂质体和磷脂体样品直接从供应商处获取并未经进一步处理。慢病毒颗粒为市售产品，按接收状态进行分析。

没有进一步的独立组成或结构...

结果与讨论

图1、图2、图3和图4展示了慢病毒、脂质体和磷脂体的代表性数据集，其中UV/LS信号、回转半径（Rg）、粒子质量和由此推算出的粒子密度作为保留时间的函数绘制出来。

结论

通过将离心场流式分离与多角度光散射结合，可以通过结合CFFFF得到的粒子质量和MALS得到的粒子尺寸，连续评估异质纳米粒子群体的有效粒子密度。

将该方法应用于脂质体、磷脂体和慢病毒颗粒，揭示了不同的质量-体积行为。负载BSA的磷脂体表现出近似恒定的有效密度，而空磷脂体...

手稿制备过程中生成式AI和AI辅助技术的声明

在准备工作期间，作者使用ChatGPT（OpenAI）协助语言编辑并提高手稿的清晰度。作者根据需要对输出进行了审阅和编辑，并对发表文章的内容负全责。

CRediT作者贡献声明

Soheyl Tadjiki：撰写——原始草稿、方法论、研究、概念化。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

作者感谢Michael Valic（加拿大多伦多大学健康网络的Porphysome Foundry）提供磷脂体和脂质体样品。

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