PBMC来源的eNK细胞通过武装新型双特异性融合蛋白16Fc21获得并促进类CAR抗肿瘤反应

《Frontiers in Immunology》：PBMC-derive eNK cells was armed and promoted CAR-like response against tumors through armed with 16Fc21, a novel bispecific fusion protein for NK cells

　　

背景：基于PBMC来源的自然杀伤（NK）细胞的细胞免疫疗法在治疗血液恶性肿瘤方面显示出巨大潜力。然而，由于体外基因修饰复杂且效率低下，以及体内对实体瘤的治疗效果不足，其应用受到限制。方法：在此，研究人员设计并构建了一种新型双特异性融合蛋白16Fc21（抗CD16A-FC-IL21），其具有调节NK细胞功能的能力，试图突破这些限制。结果：在本工作中，研究人员证明了16Fc21具有极好的诱导PBMC来源NK细胞功能活化的能力，并提高NK细胞免疫疗法对体内实体瘤的治疗效果。此外，研究人员开发了一种新的联合疗法，将NK细胞的过继转移与16Fc21相结合。研究人员将16Fc21预武装到NK细胞表面，并成功开发了一种非基因修饰的16Fc21武装NK（16Fc21 armed-eNK）技术平台。讨论：研究人员证实，这种新型联合疗法可以有效提高NK细胞在体内的存活和增殖，为增强其在体内的治疗效果提供了一种更安全、更有效的方法。该方法为克服PBMC来源NK细胞体外基因修饰繁琐和体内治疗效果不足的挑战提供了解决方案。

论文解读：PBMC来源NK细胞的新型双特异性融合蛋白16Fc21及其武装eNK细胞的抗肿瘤研究

近年来，细胞疗法在肿瘤治疗领域展现出巨大潜力，其中自然杀伤（NK）细胞因其无需预先活化即可直接杀伤肿瘤、不受主要组织相容性复合体（MHC）限制、无细胞因子风暴或神经毒性风险等独特优势，被视为下一代广谱抗癌武器。然而，基于外周血单个核细胞（PBMC）来源NK细胞的过继转移疗法仍面临两大关键瓶颈：其一，PBMC来源NK细胞发育成熟，抗病毒活性强，对病毒转导介导的基因修饰具有高抵抗力，导致体外基因修饰效率低下，且生产工艺复杂、成本高昂；其二，输注入体内的NK细胞对肿瘤组织浸润能力差，即使到达肿瘤部位，也受高度免疫抑制性肿瘤微环境的限制，存活和增殖能力受阻，抗肿瘤活性难以持久，整体疗效有限。为突破上述瓶颈，研究人员设计并开发了一种同时靶向NK细胞表面CD16A和IL-21R的新型双特异性融合蛋白16Fc21。CD16A是介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）的关键激活受体，而IL-21R通过JAK/STAT和PI3K/MAPK通路增强NK细胞的效应功能。因此，16Fc21旨在通过非基因修饰的方式增强NK细胞的激活、增殖和抗肿瘤能力。

研究人员利用K. phaffii表达系统成功构建并表达了16Fc21，通过摇瓶优化和10L发酵罐建立了稳定的生产工艺。纯化后的16Fc21纯度超过90%，且能高效结合CD16A和IL-21R，EC₅₀分别为0.226 nM和104 nM。体外实验表明，16Fc21能有效激活PBMC来源NK细胞，上调多种激活标志物（NKG2D、CD69、NKp30、CD25）、细胞毒分子（CD107a、IFN-γ、4-1BB、TRAIL）和增殖标志物Ki67的表达。进一步，研究人员建立了16Fc21预武装NK细胞（16Fc21 armed-eNK）的体外孵育体系，该体系在4°C、100 μg/mL 16Fc21浓度下孵育1小时即可完成武装，无需基因修饰。功能实验显示，16Fc21 armed-eNK对K562、HO-8910和AGS肿瘤细胞的杀伤活性显著增强，共培养上清中TNF-α、颗粒酶B（GZMB）和IFN-γ浓度显著升高。在NCG小鼠卵巢癌腹腔转移模型和AGS皮下胃癌模型中，16Fc21 armed-eNK展现出显著的抑瘤效果，甚至使部分小鼠肿瘤完全消退，存活超过120天，且疗效优于单独NK细胞输注或NK细胞联合16Fc21给药，表明其作用并非简单组合效应。体内分布实验显示，16Fc21 armed-eNK在多种器官中的存活和增殖能力均强于普通NK细胞。安全性评估表明，16Fc21 armed-eNK输注未引起血液学指标异常、器官损伤或移植物抗宿主病（GVHD），具有良好的安全性。

主要技术方法：研究人员采用K. phaffii（X33）菌株，通过同源重组将16Fc21表达框整合至基因组，经摇瓶优化（pH、温度、甘氨酸和柠檬酸钠补料）后放大至10L发酵罐，利用MabSelect亲和层析和Superdex S200凝胶过滤纯化。ELISA测定结合亲和力。使用健康供者PBMC（来源于安徽血液中心）及上海NK CellTech提供的扩增NK细胞，通过流式细胞术检测功能分子，利用CFSE和RTCA法检测杀伤活性。体内实验使用NCG小鼠，建立HO-8910-Luc腹腔瘤和AGS皮下瘤模型，通过活体成像监测肿瘤负荷，并通过血液学、血清生化和组织病理学评估安全性。

研究结果：

一、16Fc21的设计、构建与表达：研究人员构建了抗CD16A单链抗体-人IL-21-IgG4 Fc融合蛋白，通过K. phaffii同源重组筛选出高表达克隆82-5，Western blot确认其表达稳定性。

二、摇瓶水平发酵参数优化：pH 6.5、25°C条件下产量较高且蛋白聚集较少；添加3 mM甘氨酸或2 g/L柠檬酸钠可进一步提高产量。

三、中试规模发酵、纯化与表征：建立10L发酵工艺，细胞湿重达377 g/L，纯化后纯度>90%，16Fc21与CD16A和IL-21R的结合EC₅₀分别为0.226 nM和104 nM。

四、16Fc21有效激活PBMC来源NK细胞：与健康供者PBMC共培养24小时后，NK细胞表面激活标志物（NKG2D、CD69、NKp30、CD25）、细胞毒分子（CD107a、IFN-γ、4-1BB、TRAIL）和增殖标志物Ki67显著上调，同时抑制性分子Tim-3和TIGIT也升高，但CD8⁺ T细胞未受明显影响。

五、16Fc21预武装eNK细胞的建立及体外功能验证：在4°C、100 μg/mL条件下孵育1小时即可有效装载16Fc21；16Fc21 armed-eNK对K562、HO-8910和AGS杀伤活性显著增强，与HO-8910共培养后多种激活、抑制、细胞毒、趋化和黏附分子表达上调，TNF-α、GZMB和IFN-γ分泌增加。

六、16Fc21 armed-eNK体内抗肿瘤疗效：在卵巢癌NSG小鼠模型中，16Fc21 armed-eNK组肿瘤抑制最显著，3只小鼠肿瘤几乎完全消退且存活超过120天；在胃癌皮下模型中，armed-eNK疗效同样优于NK+16Fc21联合组，证明其抗肿瘤活性非简单组合效应。

七、16Fc21 armed-eNK体内增殖增强：在人源化NCG荷瘤小鼠中，16Fc21 armed-eNK组各器官及总的人CD45⁺CD56⁺细胞数量均高于普通NK组，峰值出现在第3天并维持约10-14天，表明其体内存活和增殖能力改善。

八、16Fc21 armed-eNK安全性良好：血液学检测显示白细胞、红细胞、血小板和血红蛋白无显著下降，血清生化指标正常，组织病理学未见器官损伤，小鼠体重无显著变化。

讨论总结：研究人员指出，16Fc21通过同时提供CD16A激活信号和IL-21R增殖生存信号，有效增强了NK细胞对抗肿瘤免疫抑制微环境的能力。与CAR-NK相比，16Fc21 armed-eNK无需基因修饰，仅需2小时孵育即可完成制备，显著简化生产流程并降低成本，同时避免病毒转导相关的安全隐患。尽管免疫缺陷小鼠模型不能完全反映真实患者情况，但该策略展示了独特的类CAR样功能。研究结论：研究人员设计并开发了双特异性NK细胞融合蛋白16Fc21，并通过系列实验证明了其卓越的生物学活性；同时建立了外周血来源NK细胞的体外预武装体系，为16Fc21及16Fc21 armed-eNK细胞的进一步临床应用提供了重要支持。