《Journal of Clinical Virology Plus》：Evaluation of QIAcuity digital polymerase chain reaction platform for the quantitation of JC and BK polyomaviruses
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人类多瘤病毒（HPyVs）为直径约5000碱基对环状基因组的小型二十面体双链DNA病毒。BKPyV与JCPyV在人群中普遍存在，其血清流行率随年龄增长而升高。其他近年来发现与疾病相关的人类多瘤病毒包括与罕见人类癌症相关的梅克尔细胞多瘤病毒（MCPyV）以及与实
人类多瘤病毒（HPyVs）为直径约5000碱基对环状基因组的小型二十面体双链DNA病毒。BKPyV与JCPyV在人群中普遍存在，其血清流行率随年龄增长而升高。其他近年来发现与疾病相关的人类多瘤病毒包括与罕见人类癌症相关的梅克尔细胞多瘤病毒（MCPyV）以及与实体器官移植受者罕见皮肤病相关的毛发性棘状发育不良多瘤病毒（TSPyV）。健康个体的BKPyV或JCPyV原发感染很少与疾病相关，但已有儿童出血性膀胱炎和成人无症状血尿的报道。该感染呈持续性，尿液中间或可检测到排出的病毒。尽管BKPyV的流行率高于JCPyV，但健康个体中后者在尿液中的排出更为常见。在肾移植相关的免疫抑制状态下，BKPyV以及较少见的JCPyV的失控复制可能导致临床隐匿性肾病，继而进展为肾功能衰竭，并可能与移植物排斥相混淆。BKPyV出血性膀胱炎是造血干细胞移植中免疫抑制的常见并发症。进行性多灶性白质脑病（PML）最初被确定为原发性B细胞淋巴增殖性疾病的并发症，是一种由JCPyV引起的罕见脱髓鞘性脑部感染，也见于因免疫调节治疗或获得性免疫缺陷导致T细胞抑制的患者。在具有PML相关临床及影像学表现的患者中，脑脊液（CSF）中检出JCPyV DNA具有诊断意义。由于针对这些病毒尚无标准的特异性治疗方法，减少免疫抑制或恢复免疫能力是治疗的基础。为促进抢先治疗，实验室采用定量聚合酶链反应（qPCR）监测血液、尿液或疑似PML患者的脑脊液中的HPyV载量。qPCR方法的准确性依赖于检测标准品的使用，因此结果包含样本与参照标准品两方面的两倍变异。在数字PCR（dPCR）中，样本被分配至数千个独立反应单元，并计数阳性与阴性反应单元数。作为一种无标准品依赖的方法，dPCR是qPCR的有力替代方案。此外，只要能在含阳性反应的分区中检测到终点信号，dPCR定量受样本中潜在抑制因子的影响较小。本研究将实验室自行设计的用于JCPyV和BKPyV检测及定量的双重qPCR方法转换至QIAcuity dPCR平台，并利用质粒校准品、临床样本及外部质控样本对该dPCR系统进行了评估。
**研究背景**
人类多瘤病毒（HPyVs）是一类具有环状双链DNA基因组的小型病毒，基因组长度约5000碱基对。BK多瘤病毒（BKPyV）和JC多瘤病毒（JCPyV）在人群中普遍存在，感染后持续潜伏于体内，可在免疫功能低下时被重新激活。在肾移植受者中，BKPyV的失控复制可导致病毒性肾病，而JCPyV则可在严重免疫抑制患者中引起进行性多灶性白质脑病（PML）。目前对这些病毒缺乏特异性抗病毒治疗，临床管理策略主要是减少免疫抑制强度或恢复免疫功能。定量聚合酶链反应（qPCR）是当前监测病毒载量的常规手段，但其准确性受标准品校准影响，测定结果存在固有变异。数字聚合酶链反应（dPCR）通过将样本分配至数千个独立纳升反应单元并计数阳性事件实现绝对定量，无需依赖标准曲线，理论上具有更高的定量准确性。然而，dPCR在临床病毒载量监测中的应用评估尚不充分。为此，研究人员开展本研究，旨在将实验室自行设计的JCPyV和BKPyV双重qPCR方法转换至QIAcuity dPCR平台，并系统评估该平台用于临床病毒载量定量的性能。
**研究内容与结论**
研究人员将针对大T抗原基因的双重qPCR检测方法适配至QIAcuity dPCR平台，采用含有JCPyV或BKPyV全基因组的质粒标准品、外部质量评估（EQA）样本以及131份临床样本（包括120份血浆、7份尿液和4份脑脊液）对平台性能进行验证。研究结果表明，QIAcuity dPCR在JCPyV和BKPyV DNA定量方面较qPCR具有更优的准确性。质粒稀释系列的dPCR定量结果与紫外分光光度法参考值高度一致，动态范围可覆盖绝大多数临床样本的病毒载量区间。外部质控样本检测中，dPCR定量结果与参考共识值的偏差显著小于qPCR。该研究证实，将qPCR检测流程转换至QIAcuity dPCR平台操作简便，数字PCR可作为qPCR的可行替代方案，用于提高病毒拷贝数定量的质量。
**研究技术方法**
研究使用了以下关键技术平台与方法：第一，采用QIAcuity微流控纳米板平台，每孔包含25000–26000个独立分区，通过泊松分布统计阳性分区数实现核酸绝对定量。第二，使用限制性内切酶EcoRI对环状病毒基因组进行线性化处理以保证分区均匀性。第三，临床样本核酸提取采用NucliSense eMag自动提取系统，样本包括血浆、尿液和脑脊液（CSF）。第四，纳入人类生长激素（hGH）基因作为内源性内标以监测扩增效率。第五，使用外部质量评估样本（QCMD）对两种定量方法进行标准化比较。第六，采用线性回归分析、t检验及Mann-Whitney U检验进行统计评估。
**研究结果**
**质粒标准品定量评估**
对JCPyV和BKPyV质粒进行10倍梯度稀释（0.4–40000拷贝/微升），dPCR定量在0.4–4000拷贝/微升反应范围内呈线性相关，Pearson系数R2均大于0.998。在此动态范围内，dPCR测定JCPyV和BKPyV拷贝数分别相当于分光光度法参考值的0.88倍和1.37倍。重复稀释样本的变异系数（CV）为2.0%–2.1%。对质粒对照的重复检测CV分别为4.6%（JCPyV）和1.6%（BKPyV），低于一般qPCR检测的可重复性变异。
**外部质量评估样本检测**
对两个轮次QCMD EQA样本的检测结果显示，dPCR和qPCR均正确检出了全部核心样本。在JCPyV核心样本的定量中，qPCR结果有5份样本偏离参考共识值1–2个标准差，而dPCR全部7份样本均在共识值1个标准差范围内。在BKPyV核心样本中，qPCR有5份结果偏离1–2个标准差，dPCR则有7/8份在1个标准差以内。在低拷贝教育样本中，dPCR较qPCR表现出更高的检出率。
**临床样本定性及定量一致性**
JCPyV部分：34份qPCR阳性样本中32份被dPCR检出，dPCR单独检出7份低拷贝样本。两种方法的定性一致率为93.1%。定量分析显示，两种方法共同阳性样本的Pearson相关系数R2为0.856，但dPCR测定值平均为qPCR的5.4倍，其中血浆样本差异显著（p<0.001），而脑脊液样本差异无统计学意义。样本储存时间不影响该差异。
BKPyV部分：55份qPCR阳性样本中52份被dPCR检出，3份qPCR阳性而dPCR阴性的样本病毒拷贝数均≤1拷贝/微升DNA。两方法定性一致率为97.7%。定量相关性R2为0.947，dPCR测定值平均为qPCR的0.6倍。储存时间对两种方法的定量比值有明显影响：储存0–45天的样本dPCR/qPCR比值为0.9±0.3，而储存197–280天的样本降至0.5±0.4（p<0.0005）。
**讨论**
QIAcuity dPCR平台在检测过程中自动完成分区、热循环和图像分析，实际操作流程与qPCR相似。26K纳米板的动态范围理论上限约为5600拷贝/微升反应，覆盖了绝大多数临床样本的病毒载量范围。对于尿液中BKPyV的高拷贝监测（感染干预阈值为10的6次方拷贝/毫升），可通过适当稀释样本以扩大可检测范围。在低拷贝样本中，dPCR单个阳性分区的信号被认为是可靠的阳性判定依据。本研究的局限性在于多数临床样本以冻存核酸提取物形式进行分析，未在qPCR中同时复测；且未设置恒定阳性对照以评估批间变异。但每次dPCR运行的有效分区数均稳定在25000–26000之间，且临床样本中内源性hGH内标均持续阳性，提示各批次间运行一致性良好。
**研究结论**
与qPCR相比，QIAcuity dPCR在JCPyV和BKPyV定量方面具有更优的准确性。提高定量准确性能使监测到的病毒载量变化具有更高的临床判断价值。26K纳米板的动态范围足以满足大多数临床样本的检测需求。本评估表明，dPCR是qPCR的可行替代方案，可提高病毒拷贝数定量检测的质量。该研究发表在《Journal of Clinical Virology Plus》。
