DNA浓度影响收获液中蛋白A色谱逆转录病毒清除能力

《Biotechnology Progress》：DNA concentration in harvest affects retrovirus clearance capabilities of protein A chromatography

　　

蛋白A色谱是生物制药纯化中的关键单元操作，广泛用于从收获细胞培养液（HCCF）中捕获单克隆抗体（mAbs）。除其主要功能外，蛋白A色谱也经常被测试其去除病毒的能力。尽管蛋白A特异性结合mAbs而不应与病毒相互作用，但一些研究表明，逆转录病毒的对数去除率（LRVs）可在1至4 log₁₀之间变化。这种差异已被证明取决于mAb和原料组成。然而，迄今为止尚未评估哪些原料成分影响病毒去除。为填补这一知识空白，研究人员分析了一组病毒加标研究数据，发现HCCF中的DNA含量与蛋白A色谱的LRV之间存在潜在相关性。为验证这一假设，研究人员使用鼠白血病病毒（MuLV）和逆转录病毒样颗粒（RVLP）对三种不同mAbs的加标起始材料进行了实验。总体而言，较高的HCCF DNA水平被发现可增强两种病毒颗粒的LRV。这一趋势在RVLP加标的纯mAb实验中得到了证实。此外，含有去污剂或还原剂的蛋白A色谱洗涤缓冲液被证明可改善RVLP加标实验中的LRV。本研究证明了DNA浓度对蛋白A色谱病毒去除能力的影响。这些发现尤其适用于在下游工艺早期阶段去除DNA的情况，例如通过使用功能性深层过滤器或沉淀法。

**论文解读：DNA浓度对蛋白A色谱逆转录病毒清除能力的影响**

**一、研究背景与目的**

蛋白A色谱是生物制药下游加工中广泛使用的关键纯化步骤，利用葡萄球菌蛋白A与抗体Fc结构域的选择性结合能力，从复杂的收获细胞培养液（harvest cell culture fluid, HCCF）中捕获单克隆抗体（monoclonal antibodies, mAbs）。尽管蛋白A色谱通常能够获得高纯度的mAbs，但残留的工艺相关杂质（process-related impurities, PRI）如宿主细胞DNA、染色质和宿主细胞蛋白（host cell proteins, HCP）可能残留在洗脱液中。生物制药产品如mAbs通常在中国仓鼠卵巢（Chinese hamster ovary, CHO）细胞培养物中生产，此类哺乳动物细胞培养物易受病毒感染，且基因组中携带内源性逆转录病毒样颗粒（retrovirus-like particles, RVLP）序列。因此，药物的病毒安全性是法规要求，通过三个支柱保障：（i）病毒检测，（ii）无病毒材料采购，（iii）下游工艺的病毒清除能力。

尽管近年来对下游单元操作如病毒灭活、离子交换色谱和病毒过滤的病毒清除机制已有显著进展，但蛋白A色谱的病毒去除机制仍未完全阐明。由于蛋白A对mAbs和融合蛋白Fc部分具有高度特异性，通常认为病毒流穿色谱柱而目标蛋白被保留。然而，蛋白A色谱对逆转录病毒显示出1至4 log₁₀的广泛对数去除率（logarithmic reduction values, LRVs）范围。虽然LRV对于特定mAb保持一致，但在不同mAbs之间可能存在较大差异。已有研究表明，在缺乏mAbs的情况下蛋白A色谱的病毒去除仍然有效，这表明病毒与产品组分之间的非特异性相互作用可能干扰有效的病毒去除。原料的组成似乎也起着重要作用。此前研究表明，加载纯mAbs时蛋白A色谱加标实验产生的LRV低于使用HCCF作为加载材料的运行，这导致研究者假设HCCF组分可能破坏mAb与逆转录病毒之间的相互作用。

尽管原料组成已被描述为在蛋白A色谱病毒清除能力中发挥重要作用，但尚未明确哪些组分参与这种效应。为填补这一知识空白，研究人员分析了鼠白血病病毒（murine leukemia virus, MuLV）加标研究的数据集，揭示了HCCF中DNA浓度与蛋白A色谱实现的LRV之间的相关性。该研究旨在验证DNA浓度对逆转录病毒清除的影响，并探索改善病毒去除的策略。

**二、主要技术方法**

研究人员使用了以下关键技术方法开展研究：（1）对47个项目的病毒加标研究数据库进行回顾性分析，评估HCCF中DNA和HCP浓度与MuLV LRV的相关性；（2）采用RT-qPCR对MuLV和CHO RVLP进行定量检测；MuLV病毒储备液由Charles River Laboratories提供，滴度为11.1–11.2 log₁₀ copies mL^?1，RVLP储备液购自Cygnus Technologies；（3）使用阴离子功能化深层过滤器（Emphaze AEX）处理HCCF以生成低DNA浓度原料；（4）从CHO细胞培养物中提取并超声破碎纯化DNA，用于回加实验以恢复DNA浓度至约10⁸ pg/mL；（5）以三种不同mAbs（mAb1、mAb2和mAb3）的HCCF、深度过滤HCCF、纯mAb、mAb耗竭HCCF及人工HCCF等多种基质进行MuLV和RVLP加标蛋白A色谱实验；（6）考察含去污剂Virodex? TXR-1、还原剂二硫赤藓糖醇（dithioerythritol, DTE）或半胱氨酸的洗涤缓冲液对RVLP去除的改善效果。蛋白A色谱实验使用MabSelect Prism A色谱树脂，在?KTA Pure 25系统上运行。

**三、研究结果**

**3.1 数据库评估**

研究人员对47个在相似条件下运行的项目数据进行了分析。数据表明MuLV LRV与HCCF中DNA浓度之间存在潜在相关性（R2 = 0.486）。值得注意的是，蛋白A起始材料中较低的DNA浓度似乎与较低的LRV相关。当DNA浓度降至10² pg/mL以下时，观察到LRV低于1，这被认为对病毒去除而言意义不大。数据未显示HCP浓度与LRV之间的相关性。对微小病毒（minute virus of mice, MVM）的评估未显示DNA浓度对LRV的影响。

**3.2 DNA对MuLV去除的影响**

为验证DNA浓度对病毒去除的影响，研究人员使用2%（v/v）MuLV进行了加标实验。初始实验使用三种不同mAbs的HCCF进行。为生成低DNA含量原料，HCCF经阴离子功能化深层过滤器过滤，所得原料DNA浓度为2–5000 pg/mL，与未处理HCCF相比，所有mAbs均显示较低的LRV。将纯化并片段化的CHO DNA回加至深度过滤HCCF以恢复DNA浓度至约10⁸ pg/mL后，MuLV去除显著改善，LRV恢复至与初始HCCF相当的水平。

**3.3 DNA对RVLP去除的影响**

为验证MuLV结果是否可重现于RVLP，研究人员使用RVLP RT-qPCR检测进行了进一步实验。对于mAb1，HCCF的RVLP去除LRV为2.8；使用深度过滤HCCF时LRV降至1.5；回加DNA后LRV恢复至2.4，与MuLV实验趋势高度一致。mAb2和mAb3在HCCF与深度过滤HCCF之间的LRV差异相当，回加DNA后mAb2的LRV改善明显，mAb3也呈现积极趋势。

进一步实验测试了不同加载基质对RVLP去除的影响，包括细胞培养基（cell culture medium, CCM）、mAb耗竭HCCF、纯mAb、纯mAb加DNA以及人工HCCF（mAb耗竭HCCF回加浓缩纯mAb）。基于CCM和mAb耗竭HCCF的无mAb实验显示较高的RVLP去除能力（LRV > 3.5）。纯mAbs显示低至中等程度的去除效果（LRV 1.5–2.6），且不同mAbs间存在差异。将纯mAbs的DNA浓度调整至约10⁸ pg/mL后，三种mAbs的LRV均改善至3.3–4.4，证实了DNA对LRV的积极影响。人工HCCF显示比相应HCCF更高的LRV（3.1–3.6），其中mAb3的LRV提高超过2 log₁₀。

**3.4 洗涤缓冲液评估**

研究人员选用显示最低LRV的mAb3 HCCF进行洗涤缓冲液优化实验，使用1% RVLP加标。标准洗涤缓冲液（含尿素、氯化钠和EDTA）产生LRV为1.23 ± 0.28。添加0.9 mM半胱氨酸后LRV为1.77 ± 0.29，该增加在分析变异性范围内，可能不代表实质性改善。添加0.2%去污剂Virodex? TXR-1后LRV显著提高至4.60 ± 0.15。添加0.5 mM还原剂DTE后LRV显著提升至3.55 ± 0.01。

**四、讨论与结论**

**讨论部分总结：** 本研究基于数据集和加标实验，确定DNA浓度对蛋白A色谱的病毒去除能力有影响。实验表明，DNA浓度降低时LRV降低，回加片段化CHO DNA后LRV恢复。此前的文献报道纯mAb的MuLV去除率低于含mAb的HCCF，有研究推测mAb-病毒相互作用可能由HCP介导，但本研究数据未显示HCP浓度的主要作用。不过，研究者不能排除特定HCP的影响，因为HCP ELISA捕获的是广泛异质的HCP群体而非特定蛋白浓度；此外，潜在的HCP介导效应可能在较高DNA水平下被掩盖，此时DNA介导的相互作用占主导地位。使用阴离子功能化深层过滤器生成低DNA HCCF时，此类过滤器除去除DNA外，还可能减少HCP、核酸相关复合物、细胞碎片和膜碎片，这些因素也可能导致病毒清除行为变化。尽管DNA的积极影响已通过纯化DNA回加实验得到证实，但不能排除其他共去除杂质的贡献。

关于DNA介导病毒清除增强的机制，研究者提出了几种假说。基于DNA-LRV相关性，第一个假设是DNA与mAb之间可能存在静电相互作用，这种相互作用可能屏蔽mAb表面，从而减少与MuLV或RVLP的相互作用。然而，蛋白A色谱通常至少使用一个含高盐浓度的洗涤缓冲液来应对静电相互作用，因此DNA的存在可能干扰其他共纯化机制，如逆转录病毒与mAb之间的低亲和力相互作用，或mAb与病毒之间分子间二硫键的形成。不同mAbs之间LRV的差异支持了产品特异性病毒-mAb相互作用作为蛋白A色谱病毒去除限制因素的主要驱动因素。RVLP与MuLV实验结果的差异可能归因于颗粒的相互作用历史：与mAb共表达的RVLP在长时间内暴露于HCCF环境，可能与mAb、DNA或其他杂质形成并稳定相互作用；而加标RVLP仅有限时间暴露于基质，可能产生较少的相互作用。洗涤缓冲液添加剂的效果支持了两种机制：去污剂TXR-1通过裂解逆转录病毒脂质膜实现有效去除，而还原剂DTE可能通过还原mAb与病毒表面蛋白之间潜在的分子间二硫键来改善去除效果。但将去污剂或还原剂引入洗涤缓冲液需考虑难以区分物理去除与化学灭活的贡献，以及还原剂可能对产品自身质量产生不利影响的风险。

**研究结论：** 在本研究中，研究人员证明了HCCF中的DNA含量可影响逆转录病毒的去除。低DNA浓度的起始材料与较低的LRV相关。这一发现尤其重要，当计划在蛋白A色谱之前使用过滤器、沉淀或其他已知可减少DNA的方法时。研究人员还证明了这种相关性在MuLV和RVLP中均可观察到。尽管揭示DNA含量与逆转录病毒去除之间相关性的作用机制超出了本研究范围，但研究结果可能有助于更好地理解蛋白A色谱的病毒去除机制，并为下游工艺的病毒清除设计提供支持。该论文发表在《Biotechnology Progress》。