一种pH响应型荧光寿命探针揭示GOT1在细胞抗衰老中的相分离

《Smart Molecules》：A pH-Responsive fluorescence lifetime probe reveals GOT1 phase separation in cellular anti-senescence

　　

细胞衰老涉及进行性酸化，但细胞如何感知并适应这种pH变化仍不清楚。本研究报道了代谢酶GOT1作为一种pH传感器，通过发生液-液相分离（LLPS）来对抗衰老。蛋白质组学分析鉴定出GOT1在衰老的人类肺细胞中表达上调。模拟衰老的酸性环境通过其N端固有无序区域（IDR1）直接诱导GOT1发生LLPS，并招募ME1形成动态的酶共凝聚体，从而清除活性氧（ROS）并减轻氧化应激。为了定量探究衰老过程中GOT1的pH微环境，研究人员设计了BDP-PLP——一种首创的荧光探针，将GOT1天然辅因子磷酸吡哆醛与BODIPY荧光团偶联。该探针通过结合抑制型光致电子转移（PET）机制发挥作用，实现了对GOT1的高特异性靶向以及pH依赖的荧光寿命成像（FLIM）。利用FLIM，研究人员在活细胞中实现了对GOT1凝聚体内pH动态变化的定量实时可视化，揭示出相分离产生的高度酸性局部微环境对其抗衰老功能至关重要。本研究揭示了一种由pH触发的相分离机制，通过代谢酶共凝聚增强抗氧化防御，为衰老过程中的代谢适应提供了新视角，并建立了探测微环境动态变化的化学工具。

**论文解读：pH响应型荧光寿命探针揭示GOT1相分离在细胞抗衰老中的调控机制**

**1. 研究背景与科学问题**

细胞衰老是细胞增殖稳定停滞的状态，与机体衰老及年龄相关疾病密切相关。除了经典的细胞周期退出和衰老相关分泌表型（SASP）外，衰老细胞还表现出显著的代谢重编程和离子稳态改变。近年来的研究强调细胞内pH稳定性对正常细胞功能至关重要，而衰老细胞常呈现更为酸性的细胞质环境。然而，这种酸性转变究竟是衰老的被动结果，还是主动塑造衰老表型和细胞命运的调控信号，仍是悬而未决的科学问题。理解细胞如何感知酸胁迫并将其转化为适应性反应，是解析衰老生物学的关键一步。

在此背景下，液-液相分离（LLPS）已成为生物分子组装成无膜细胞器、调控基因表达和应激适应的基本物理机制。多种代谢酶可在特定生理或应激条件下发生相分离，从而精确调控细胞内代谢。然而，在细胞衰老相关的酸性环境中，是否存在通过特定分子机制调控细胞生长状态的代谢传感器，仍待深入研究。

**2. 研究内容概述**

该研究通过定量蛋白质组学分析、体外生化重构、细胞功能验证、探针开发与荧光寿命成像（FLIM）等多学科技术手段，系统揭示了代谢酶GOT1作为pH传感器通过相分离对抗细胞衰老的分子机制，并开发了pH响应型荧光寿命探针BDP-PLP以实现活细胞内GOT1微环境pH的定量可视化。论文发表在《Smart Molecules》。

**3. 主要关键技术方法**

该研究采用的核心技术包括：基于高分辨质谱（HRMS）的定量蛋白质组学和KEGG通路富集分析（样本来源为严格年龄匹配的年轻与老年供体外周血细胞和血清）；生物信息学分析（利用GTE x数据库755例人肺组织转录组数据、ADEIP数据库、分子对接和100 ns分子动力学模拟）；体外相分离重构实验（PEG-1000分子拥挤剂、荧光恢复后光漂白（FRAP）、动态光散射（DLS））；细胞衰老模型（人支气管上皮BEAS-2B和HEK293细胞，博来霉素诱导衰老）；以及基于BODIPY骨架的pH响应型荧光寿命探针BDP-PLP的合成与FLIM成像。

**4. 研究结果**

**4.1 蛋白质组学和生物信息学筛选鉴定GOT1**

研究人员对年轻和老年供体外周血细胞和血清进行定量蛋白质组学分析，通过火山图和聚类分析筛选差异表达蛋白（DEPs），发现GOT1在老年样本中显著上调。KEGG通路富集分析显示丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢通路显著富集。对GTE x数据库755例人肺组织转录组数据分析表明，GOT1转录水平与供体年龄呈显著正相关。qPCR验证了衰老BEAS-2B细胞中GOT1 mRNA水平的显著上调。

**4.2 GOT1相分离机制及pH依赖性**

活细胞成像显示，酸胁迫处理可诱导GOT1-GFP从弥散分布转变为球形荧光凝聚体，且呈剂量依赖性。FRAP实验显示约70%的荧光恢复，1,6-己二醇处理破坏凝聚体形成，表明其为典型的液-液相分离。体外重构实验确认纯化的GOT1在PEG-1000存在下自发形成球形液滴，pH 5.0时相分离能力最强。计算预测和突变分析证明N端IDR1是通过质子化调节静电平衡、驱动pH依赖性相分离的关键区域。

**4.3 GOT1相分离对细胞衰老的功能验证**

药物诱导GOT1相分离不改变总谷草转氨酶（GOT）活性，排除了经典酶活性的直接贡献。GOT1过表达并诱导相分离可显著减少SA-β-gal阳性细胞比例、下调衰老标志物p21的mRNA和蛋白水平；而GOT1敲低则加重衰老。表达ΔIDR1突变体的细胞p21水平显著高于野生型，证明GOT1通过相分离能力而非其他内在蛋白特性发挥抗衰老功能。长时间（24小时）酸化显著增加SA-β-gal阳性细胞，而短时间（2小时）处理无此效应，提示局部酸性微环境可能是调控衰老进程的细胞信号。

**4.4 酸性应激触发GOT1与ME1协同相分离**

生物信息学预测和分子对接模拟显示GOT1与苹果酸酶1（ME1）存在强相互作用。共表达实验证实酸性应激下两蛋白快速共定位形成球形凝聚体，且严格依赖GOT1的相分离能力——GOT1抑制剂处理或IDR1缺失均使ME1无法形成凝聚体。FRAP确认共凝聚体具有液体性质，并在BEAS-2B细胞中验证了现象的普适性。功能研究表明共凝聚体的形成显著下调p21表达并抑制细胞内活性氧（ROS）积累。

**4.5 GOT1靶向pH响应荧光寿命探针**

研究人员设计了BDP-PLP探针，将GOT1天然辅因子磷酸吡哆醛（PLP）通过Knoevenagel缩合偶联到BODIPY荧光团上。分子对接和MD模拟确认其稳定结合于GOT1的PLP结合口袋，关键残基包括GLY-109、SER-256、VAL-18、ASN-195和TRP-141，MM-PBSA计算总结合自由能为-27.60±6.91 kcal/mol。该探针通过结合抑制型光致电子转移（PET）机制实现高特异性GOT1检测。pH 3.0-10.0范围内，荧光强度随pH升高而降低，荧光寿命与pH呈线性正相关，且不受溶剂极性和粘度干扰。

**4.6 FLIM定量评估细胞内pH动态**

利用BDP-PLP结合FLIM，研究人员实现了活细胞中GOT1凝聚体的特异性标记和pH定量成像。衰老细胞平均荧光寿命（τ=2.388 ns，约pH 6.4）显著低于年轻细胞（τ=2.660 ns，约pH 7.0），确认衰老伴随的细胞质整体酸化。凝聚体内部荧光寿命（τ=2.278 ns）低于周围弥散区域（τ=2.660 ns），表明相分离伴随局部微环境酸化。梯度药物浓度实验显示凝聚体区域随浓度增加而扩大，荧光寿命随之降低。通过建立荧光寿命-pH校准曲线，成功将FLIM信号转换为绝对pH值。

**5. 讨论与结论**

该研究揭示了一个由pH触发、通过代谢酶共凝聚增强抗氧化防御的细胞抗衰老新机制：衰老相关的酸性环境通过GOT1的N端IDR1诱导其发生液-液相分离，招募ME1形成动态代谢共凝聚体，作为NADPH再生和ROS清除的功能枢纽，打破衰老相关的氧化应激正反馈循环。同时，GOT1凝聚体形成的酸性微环境本身可能作为反馈信号调控衰老进程。BDP-PLP探针和FLIM技术结合，实现了活细胞亚细胞分辨率下pH动态的定量可视化。综上，pH驱动的GOT1相分离在调控氧化还原稳态和延缓衰老中发挥关键作用，为年龄相关病理干预提供了新靶点和概念框架，所发展的分子探针与成像方法为研究生物过程的物理化学基础提供了有力工具。