基于烟草花叶病毒样颗粒液晶中间相的自组装层级结构材料

《Small》：Self-Assembly of Hierarchically Structured Materials From Liquid Crystalline Mesophases of Tobacco Mosaic Virus-Like Particles

　　

摘要
许多生物材料卓越的性能归因于其蛋白质亚基在多个长度尺度上的层级组织，这推动了下一代仿生材料设计的发展。然而，对蛋白质自组装形成高阶结构机制的有限理解阻碍了我们模仿自然的能力。在此，我们证明重组生产的烟草花叶病毒外壳蛋白（TMVcp）能够利用溶致液晶（LC）作为瞬态前驱体相，自组装形成层级结构的宏观材料。TMVcp螺旋杆在受控的pH和离子条件下形成，随后采用干燥液滴技术（该技术通过结合机械剪切和脱水有效模拟生物纤维的制造过程）将其加工为宏观尺度的纤维状结构。流体相的偏振光显微镜（PLM）观察到双折射现象，表明存在液晶取向排列，而偏振共聚焦拉曼光谱确认了组装纤维内天然TMVcp折叠结构的保留。同步辐射小角X射线散射（SAXS）进一步揭示了TMVcp螺旋杆的紧密六方堆积排列，且这些螺旋杆沿纤维轴定向排列，表明存在高度有序的纳米尺度组织。这些结果凸显了病毒样颗粒（VLPs）作为阐明和工程化层级生物材料自组装模型系统的潜力，为开发用于先进应用的可持续、可调谐蛋白质基材料开辟了新途径。

**层级结构材料自组装研究解读：从烟草花叶病毒样颗粒液晶中间相到宏观纤维**

**1. 研究背景与问题提出**

自然界中许多高性能生物材料，如海洋贻贝足丝和蜘蛛丝，其卓越的力学性能（如高韧性、自愈合能力和水下粘附性）均源于蛋白质亚基从纳米尺度到微观尺度的精确层级组织。这种从分子到宏观的层级结构是合成聚合物材料难以企及的。尽管以AlphaFold和Chai为代表的人工智能算法已在蛋白质折叠结构乃至寡聚状态的预测上取得重大突破，但这些方法目前仍无法预测蛋白质在多尺度材料中的组织方式。因此，对蛋白质高阶自组装规律的认知缺失，构成了从头设计生物聚合材料的主要障碍。

近年来，研究发现众多生物材料在形成过程中会利用流体蛋白质凝聚体（包括液-液相分离（LLPS）形成的凝聚层和液晶（LC）相）作为可塑且浓缩的前驱体相，通过精确控制pH、离子浓度、氧化还原条件和机械剪切等物理化学输入，快速加工为具有层级组织的固体材料。其中，各向同性的凝聚层相和LLPS在粘合剂和水凝胶领域已获广泛关注，而各向异性的LC相在制备取向排列的纤维状材料方面潜力巨大但研究相对不足。例如，贻贝通过将特化的胶原蛋白在分泌囊泡中预组织为近晶相液晶，经机械剪切取向和pH触发交联，形成兼具Kevlar级韧性和巨大阻尼容量的自愈合纤维。然而，蛋白质利用液晶相从纳米尺度自组装到宏观尺度的机制仍不明确。

烟草花叶病毒（TMV）天然具有形成溶致液晶的能力，其单体为直径15–18 nm、长度300 nm的刚性螺旋杆状结构。然而，天然TMV含有病毒基因组，限制了其作为蛋白质基材料构筑模块的适用性。重组表达的烟草花叶病毒外壳蛋白（TMVcp）作为病毒样颗粒（VLP），不含遗传物质，安全性更高，且能在适当的物理化学条件下自组装为螺旋杆状结构。研究表明，TMVcp在不同pH和离子强度下可自组装为单体、盘状以及螺旋杆和堆积盘两种杆状结构。尽管因缺乏RNA导致杆长呈现多分散性，但理论研究表明不同长径比杆状分子的混合物仍可形成液晶相。因此，利用TMVcp螺旋杆构筑液晶相并加工为层级结构材料，是一种可行的仿生策略。

**2. 研究内容与核心结论**

本研究旨在证明，利用重组TMVcp杆状结构形成的液晶流体蛋白凝聚体，可以制备具有纳米至微米级层级结构的毫米级蛋白质基纤维状材料。研究人员采用干燥液滴技术——将TMVcp螺旋杆溶液悬滴于两根蜡封毛细管之间，在环境条件下蒸发，使浓度缓慢增加的同时沿毛细管轴向引入剪切力，从而模拟生物纤维形成过程中的机械剪切与脱水作用——成功可重复地制备了长度约1–2.5 mm、直径约50–350 μm的宏观纤维（文中称为“filaments”）。

通过偏振光显微镜（PLM）观察到纤维的强双折射现象，表明TMVcp杆状亚基沿纤维轴存在择优取向。结合一阶 retardation plate（λ波片）分析确定了纤维层级结构的快轴平行于纤维轴。干燥过程的实时PLM跟踪揭示了蒸发过程中各向同性溶液向各向异性液晶相的瞬态转变。值得注意的是，干燥末期双折射 retardation 颜色由蓝转黄，研究将其归因于水从TMVcp中央孔道及杆间逸出并被折射率更低的空气替代所致；乙醇浸润实验（颜色由黄转蓝并可逆）进一步支持了这一假说，同时也表明形成的纤维中TMVcp杆的中央孔道保持完整且可及。

偏振共聚焦拉曼光谱分析表明，干燥纤维的酰胺I带（1657 cm^?1）和酰胺III带（1338 cm^?1）峰位清晰指示TMVcp亚基在纤维形成过程中保持了以α-螺旋为主的天然折叠构象，未发生向β-折叠的转变。此外，色氨酸残基1555 cm^?1振动峰（吲哚环C2=C3伸缩振动）的强度随激光偏振角呈正弦变化，且极大值出现在与纤维轴近似垂直的方向（75°–90°和255°–270°），表明氨基酸侧链尺度上也存在择优取向，进一步证实了TMVcp三级和四级结构在加工过程中的完整性。

同步辐射小角X射线散射（SAXS）对中间结构层次的解析尤为关键。纤维的二维衍射图样经径向积分后呈现清晰且可重复的衍射峰。方位角分析表明，某些反射主要沿赤道方向（垂直于纤维轴），另一些沿子午线方向（平行于纤维轴）。通过赤道方向峰位比值分析，发现前五个峰的q/q*比值（1, 1.731, 1.994, 2.623, 3.042）与二维六方p6mm晶格的布拉格反射理论值（1, √3, √4, √7, √9）高度吻合（偏差<2%），据此计算出晶格参数a=15.97 nm，对应相邻螺旋杆的中心距。该值低于TMV常报道的18 nm直径，但与早期TMV干凝胶的X射线和电子显微镜研究（15 nm）一致，并可由TMV螺旋几何导致的蛋白壳层互插现象解释。子午线方向检测到对应d间距约2.27 nm和2.09 nm的两个峰，分别与TMVcp螺旋杆的螺旋螺距和堆积盘构象中相邻盘间距一致，表明纤维由螺旋杆和堆积盘亚基的混合群体组成，二者均平行于纤维轴组装入六方晶格。对照实验表明，同等干燥条件下高浓度牛血清白蛋白（BSA）溶液形成的固体材料不产生任何衍射峰，证明观察到的层级组织是TMVcp杆状结构特有的自组装属性。

**3. 关键技术方法**

本研究核心涉及以下关键技术手段：1）重组蛋白表达与纯化——采用pET20b载体在大肠杆菌中表达TMVcp，经硫酸铵沉淀和DEAE Sepharose阴离子交换层析纯化，获得纯度合格的单体蛋白；2）可控自组装——将15 mg mL^?1 TMVcp单体在10 mM醋酸盐缓冲液（pH 5.0）中透析过夜，形成多分散螺旋杆（长度14–1275 nm，均值235 nm；宽度14–21 nm，均值18 nm），透射电子显微镜（TEM）确认组装产物；3）干燥液滴成纤技术——借鉴已有方法（如淀粉样纤维干燥成纤），将含TMVcp螺旋杆的小液滴悬于合成纸支架上两根蜡封硼硅酸盐毛细管之间（间距1.5 mm），在室温（22°C）和相对湿度35%条件下蒸发形成宏观纤维（蛋白浓度需为15 mg mL^?1，低浓度BSA在10–25 mg mL^?1范围内无法成材）；4）多尺度结构表征——偏振光显微镜（PLM，配备一阶 retardation plate）监测液晶相转变与取向；偏振共聚焦拉曼光谱探测蛋白质二级结构（酰胺I/III带）及氨基酸侧链取向（Trp 1555 cm^?1峰）；同步辐射小角X射线散射（SAXS，加拿大光源CLS BXDS-WLE束线，光子能量9846.6 eV，样品到探测器距离2337 mm）解析纳米尺度周期性堆积结构，数据经GSAS-II软件处理，峰值拾取采用Python程序计算负二阶导数完成。样本队列方面，SAXS分析基于4个独立TMVcp纤维样本，拉曼光谱基于3次独立测量。

**4. 研究结果分述**

**4.1 TMVcp杆可重复自组装为层级结构宏观纤维**
TMVcp单体经纯化确认（SDS-PAGE约18 kDa条带），透析形成多分散螺旋杆后，通过干燥液滴技术可重复制备宏观纤维。PLM显示纤维具有强双折射，纤维轴方向与偏振器呈约45°时双折射最大，平行或垂直时部分消光，表明TMVcp杆沿纤维轴择优排列。λ波片分析确定快轴平行于纤维轴。干燥过程的实时PLM跟踪显示液滴初始为各向同性（10 min无双折射），41–63 min出现蓝色双折射信号，表明在流体状态下发生了向各向异性液晶相的转变；81 min完全干燥形成固体纤维。干燥末期双折射颜色从蓝快速翻转为黄，经乙醇浸润实验（颜色翻转可逆）证实是由TMVcp中央孔道及杆间水分被空气替代导致折射率变化所致，而非杆取向突变，同时证明纤维中杆的中央孔道保持完整且可及。

**4.2 偏振共聚焦拉曼光谱研究蛋白质构象与取向**
干燥纤维的拉曼光谱显示酰胺I带峰位于1657 cm^?1、酰胺III带主峰位于1338 cm^?1，清晰表明TMVcp亚基保持以α-螺旋为主的天然构象，未发生向β-折叠的转变。偏振拉曼光谱中平行与垂直方向谱图相似，仅显示α-螺旋相对纤维轴的轻微择优取向，这与TMVcp螺旋杆内α-螺旋主要沿径向指向中央孔道、部分螺旋平行于入射激光束不贡献偏振响应的结构特征相符。Trp侧链1555 cm^?1振动峰强度随激光偏振角呈正弦变化，极大值出现在约75°–90°和255°–270°（近似垂直于纤维轴），表明色氨酸侧链在纤维中存在平均择优取向，进一步证实TMVcp在纤维形成过程中保留了三级和四级结构。

**4.3 同步辐射SAXS揭示TMVcp螺旋杆形成六方晶格**
纤维的SAXS衍射图样经径向积分产生清晰且样本间一致的衍射峰，表明纤维内存在周期性组织。方位角分析显示不同反射分别主要沿赤道和子午线方向分布。赤道方向峰的比值分析（1, 1.731, 1.994, 2.623, 3.042）与二维六方p6mm晶格理论值高度吻合，证明TMVcp螺旋杆在垂直于纤维轴方向呈现六方密排堆积，晶格参数a=15.97 nm（中心距）。该值低于TMV水合直径18 nm，但与TMV干凝胶的早期报道（15 nm）一致，并可由螺旋几何导致的蛋白壳层互插解释。子午线方向检测到d=2.27 nm和2.09 nm两个峰，分别归属为TMVcp螺旋杆的螺距和堆积盘构象的相邻盘间距，表明纤维由螺旋杆和堆积盘亚基混合组成。对照实验显示，TMVcp杆溶液（15 mg mL^?1）的SAXS图样呈现空心圆柱体的形状因子特征（与文献报道的TMV溶液散射一致），与纤维的布拉格反射完全不同；高浓度BSA蒸发形成的固体不产生任何衍射峰，证实观察到的层级组织为TMVcp杆特有。

**5. 总结与讨论**

综合PLM、偏振拉曼和SAXS的多尺度表征结果，本研究明确证明TMVcp杆状结构具有通过干燥液滴方法自组装为跨长度尺度各向异性层级结构的内在能力。证据链支持瞬态溶致液晶相在蒸发过程中对杆的预取向起关键作用，机械剪切力则可能驱动液晶指向矢沿纤维轴的全局排列。天然TMV及其他杆状病毒形成溶致液晶的已知能力为这一组装模型提供了支持，尽管本研究中TMVcp杆因缺乏RNA而呈多分散性，但仍能实现高度有序的层级自组装，这与理论预期相符。

本研究的核心意义在于：第一，确立了TMVcp亚基作为研究多尺度层级蛋白质自组装的模型系统，鉴于其可自组装为多种构象以及天然TMV可形成液晶的特性；第二，验证了利用流体凝聚体（特别是液晶相）作为中间相有效实现层级结构材料生物组装假说，并证明重组病毒样颗粒可作为有效的材料构筑模块；第三，由于TMVcp自组装的超分子化学和环境影响因素已在药物递送和组织工程领域被广泛研究，这些知识可为未来开发新型自组装层级结构材料提供依据。

关于未来应用，TMVcp组装可通过天然序列的点突变进行系统调控，且TMV已被证明能促进组织再生，表明这些自组装层级结构可被进一步修饰以获得具有生物医学相关性的新结构。此外，基于TMVcp在纳米尺度模板化纳米颗粒的成熟能力（如用于光捕获和电催化），本研究发现为纳米颗粒的跨长度尺度排列提供了可能——从纳米到宏观的组织可实现结构依赖性光学、电学或磁学性能的调控。当前制备的纤维在完全干燥时较短且机械脆性，但可与纳米纤维素、胶原或合成聚合物等生物相容性支架复合，形成具有可调力学性能的复合材料。总而言之，本研究证明利用液晶凝聚相作为自组装纤维和蛋白质基材料的前驱体，是开发用于生物医学工程和等离子体光子学等领域下一代可持续层级材料的可行途径。

论文结论指出：该研究证明了TMVcp螺旋杆通过干燥液滴方法自组装为层级结构宏观纤维的能力；多尺度表征表明蒸发过程中的瞬态溶致液晶相转变促进了从流体到固体转变过程中的多尺度结构组织；这些观察凸显了TMVcp VLP作为研究基础层级自组装的有趣模型系统。未来工作将聚焦于阐明自组装过程的细节，并利用这些见解更好地控制或调节所得结构和性能。蛋白质自组装为层级结构纤维的机制仍未完全阐明，深入了解温度、湿度、pH、离子强度、浓度和机械剪切等外源和内源因素对最终结构的影响将有助于阐明组装机制，以实现材料性能的调控和设计。此外，TMVcp VLP此前未报道的向列型液晶态，仍值得更深入探索以提取物理化学见解，增进理解并推动先进材料的开发。