《Nature Microbiology》：BCL-2 inhibition at antiretroviral therapy initiation reduces the intact SIV reservoir in macaques
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摘要：抗凋亡分子BCL-2有利于HIV感染过程中CD4+ T细胞病毒库的维持。BCL-2抑制能否导致HIV病毒库的长期减少尚不明确。研究人员在24只猿猴免疫缺陷病毒（simian immunodeficiency virus, SIV）感染的恒河猴感染后第14
摘要：抗凋亡分子BCL-2有利于HIV感染过程中CD4+ T细胞病毒库的维持。BCL-2抑制能否导致HIV病毒库的长期减少尚不明确。研究人员在24只猿猴免疫缺陷病毒（simian immunodeficiency virus, SIV）感染的恒河猴感染后第14天启动抗逆转录病毒治疗（antiretroviral therapy, ART），单独使用或联合10天维奈克拉（venetoclax）或维奈克拉与CD8α耗竭治疗，并随访至感染后第294天。研究人员报告，在维奈克拉治疗的恒河猴血液和淋巴结中，完整SIV病毒库出现快速且持续的减少。维奈克拉治疗后存活的CD4+ T细胞在离体实验中表现出凋亡敏感性部分降低。这些细胞表现出抗凋亡分子BCL-2和BCL-xL表达升高，同时促凋亡分子（如PUMA）表达降低。这些发现支持延长维奈克拉给药方案的合理性，并提示将BCL-2抑制与靶向其他抗凋亡分子的药物联合使用可增强HIV治愈策略中病毒库的清除效果。
**抗凋亡靶向策略在SIV感染恒河猴模型中减少完整病毒库的研究解读**
**研究背景与问题**
HIV和SIV感染即使在长期有效的抗逆转录病毒治疗（ART）下仍持续存在，其根本原因在于感染早期即建立的长期存活的CD4+ T细胞病毒库。这些细胞处于潜伏或转录活跃状态，一旦ART中断即可重新引发病毒复制。BCL-2家族的抗凋亡蛋白在维持这些感染细胞存活中发挥关键作用。HIV感染者的病毒库富集于表达IL-7R和OX40等存活受体的CD4+ T细胞中，这些受体可上调BCL-2表达。机制上，HIV蛋白酶可诱导pro-caspase-8裂解产生Casp8p41，该片段可致细胞凋亡敏感化；然而感染细胞过表达BCL-2，通过结合并使Casp8p41失活来阻止细胞死亡。BCL-2抑制可恢复Casp8p41的促凋亡活性，同时还能通过隔离Bid并阻止线粒体膜透化来增强CD8+ T细胞和NK细胞介导的杀伤作用。维奈克拉作为一种已获批准用于肿瘤治疗的BCL-2抑制剂，在人源化小鼠HIV感染模型中显示出减少完整前病毒DNA的潜力，但其在高度临床相关的非人灵长类模型中的效果尚待验证。基于此，研究人员开展了本研究，以评估在ART启动时给予维奈克拉对SIV感染恒河猴病毒库的影响。
**研究概述**
研究人员在24只感染条形码标记的SIVmac239M的恒河猴中，于感染后第14天启动ART（替诺福韦、多替拉韦和恩曲他滨联合方案），并将动物分为三组：仅接受ART的对照组、ART联合10天每日维奈克拉给药组、以及ART联合维奈克拉与抗CD8α耗竭抗体MT807R1组。研究随访至感染后第294天。研究设计还纳入了CD8α耗竭组，以评估CD8+ T细胞的溶细胞活性在维奈克拉抗病毒库效应中的作用。该研究发表在《Nature Microbiology》期刊上。
**主要关键技术方法**
本研究采用的主要技术方法包括：流式细胞术用于免疫细胞亚群鉴定和BCL-2表达分析；完整前病毒DNA检测（intact proviral DNA assay, IPDA）定量完整SIV DNA拷贝数；血浆病毒载量的RT-qPCR检测；批量RNA测序结合差异表达基因分析和基因集富集分析；非线性混合效应模型建模分析病毒库衰减动力学。样本来源于24只印度来源恒河猴的外周血和淋巴结。
**研究结果**
**BCL-2抑制对ART启动时免疫细胞动态的影响**
研究首先通过流式细胞术在感染后第14天鉴定出SIV感染的p27+ CD4+ T细胞，发现这些细胞在血液和淋巴结中均表达更高水平的BCL-2。在维奈克拉治疗的恒河猴中，CD4+ T细胞总数及各主要亚群（包括初始、记忆、中央记忆和过渡记忆细胞）在治疗结束时（第25天）较基线和对照组显著降低，但这种减少是暂时的，至第294天各亚群水平恢复至与对照组无显著差异。维奈克拉治疗还减弱了记忆TH17、TH1、TH2、循环滤泡辅助T细胞和调节性T细胞在ART启动后的正常扩增。
**BCL-2抑制调节CD4+ T细胞的死亡和存活程序**
RNA测序分析显示，维奈克拉治疗结束时CD4+ T细胞中有1279个基因上调和638个基因下调，这些变化是暂时的。上调基因包括凋亡相关基因（DRAM1、APAF1、NOD2）、凋亡诱导受体基因（TNFRSF10A、TNFRSF1A、TNFRSF21、TNFRSF8）、焦亡相关基因（CASP1、CASP4、GSDMD、GSDME等）、铁死亡相关基因（ALOX12、LPCAT3）和坏死性凋亡相关基因（TLR4、TICAM1）。同时，多个促凋亡基因下调，包括编码PUMA的BBC3、GZMB、BTG1等。存活通路方面，BIRC2、API5、IL7R、JAK1等抗凋亡和存活基因下调，而BCL2L1（编码BCL-xL）、IL10等基因上调。基因集富集分析确认了凋亡正负调控通路的富集。
**维奈克拉诱导完整SIV病毒库的快速和持续减少**
IPDA定量结果显示，维奈克拉治疗的恒河猴在治疗结束时（第25天）外周血CD4+ T细胞中完整SIV DNA水平即出现显著降低，并持续至第70、179和294天。计算第14至294天的曲线下面积发现维奈克拉组的完整SIV DNA显著低于对照组。双相衰减模型拟合显示，维奈克拉使病毒库的快速衰减相加快1.5倍，慢速衰减相加快1.2倍。整合CD4+ T细胞绝对数计算每毫升血液中完整SIV DNA时，维奈克拉治疗组在第25天即显示0.668 log10的显著降低，且持续至随访结束。淋巴结中的完整SIV DNA在维奈克拉治疗的恒河猴中于第70天显著降低，在第294天也观察到较低水平。
**CD4+ BCL-2+细胞被维奈克拉减少，残留细胞单细胞BCL-2表达升高**
维奈克拉治疗后，血液和淋巴结中记忆（而非初始）CD4+ BCL-2+ T细胞的频率持续低于对照组。然而，存活的记忆和初始CD4+ BCL-2+ T细胞表现出更高的单细胞BCL-2表达（MFI），该升高持续至第70天并在第294天恢复正常。表型分析显示，BCL-2+记忆CD4+ T细胞较BCL-2?细胞具有更高的中央记忆细胞频率、更低的过渡记忆细胞频率，表达更高的IL-7R和更低的PD-1、CCR5、CXCR3，表明其具有增强的存活潜力和较低的活化状态。
**维奈克拉治疗的恒河猴CD4+ T细胞在离体条件下仍对BCL-2抑制敏感**
离体再处理实验显示，维奈克拉治疗组与对照组的CD4+ T细胞在总死亡细胞和凋亡细胞频率上无显著差异。然而，维奈克拉治疗组中BCL-2高表达的CD4+ T细胞在0.1 μM维奈克拉浓度下较对照组表现出更低的死亡和凋亡敏感性，而BCL-2中等表达细胞仍保持同等或增强的敏感性。在维奈克拉治疗组内部比较中，BCL-2中等表达细胞的死亡和凋亡频率显著高于BCL-2高表达细胞。
**维奈克拉治疗的恒河猴病毒库清除的免疫相关性分析**
相关分析发现，病毒库衰减幅度与多种CD4+ T细胞亚群（记忆、中央记忆、过渡记忆、TH17、Tfh、Treg和TH1）在第25天的数量减少显著相关，与非经典单核细胞计数减少也相关。较大的病毒库衰减与记忆和效应记忆CD4+ T细胞中BCL-2表达升高、以及离体维奈克拉再处理后死亡和凋亡细胞频率升高相关。多重线性回归分析显示，第25天记忆CD4+ T细胞计数、记忆CD4+ T细胞BCL-2表达和离体维奈克拉暴露后BCL-2中等表达CD4+ T细胞死亡百分比这三个变量共同解释了早期病毒库衰减变异的57%。
**讨论与结论**
本研究表明，在ART启动时进行短期的BCL-2抑制可加速ART期间病毒库的衰减。维奈克拉治疗降低了表达BCL-2的CD4+ T细胞频率，但存活细胞表现出BCL-2和BCL-xL表达上调，这与慢性淋巴细胞白血病患者中观察到的现象一致。转录组分析显示存活CD4+ T细胞中PUMA等促凋亡基因表达降低，提示表观遗传学沉默PUMA可能有助于感染细胞在BCL-2抑制后持续存在。研究还发现mTOR信号和氧化磷酸化通路的富集，提示代谢适应是潜在的存活机制。值得注意的是，维奈克拉单独治疗与联合CD8α耗竭的病毒学和免疫学读数相似，表明维奈克拉的促凋亡活性不依赖于CD8+ T细胞的溶细胞作用。该研究为BCL-2抑制在ART启动时机清除病毒库的疗效提供了机制性见解，支持延长维奈克拉给药并与靶向其他抗凋亡通路的药物联合应用以增强HIV治愈策略中病毒库清除效果的研究方向。
**结论**
本研究证明了ART启动时短期BCL-2抑制可限制SIV持续存在的有效性，揭示了维奈克拉诱导的病毒库相关CD4+ T细胞死亡的机制性见解，支持在HIV治愈策略中评估延长维奈克拉给药联合靶向额外抗凋亡分子药物以增强病毒库清除的研究方向。
