《Nature Plants》：Mapping genetic modifiers of epimutation rates identifies VIM2/4 as dosage-sensitive negative regulators of CG methylation maintenance
编辑推荐：
自发表观突变是胞嘧啶甲基化的随机获得和丢失，源于细胞分裂过程中甲基化维持的不完美。在CG位点，这类表观突变可在植物中跨代遗传，并构成CG甲基化（mCG）多样性的主要来源。然而，mCG继承保真度在不同基因型间存在差异的原因，以及这种差异与稳态mCG水平之间的关系
自发表观突变是胞嘧啶甲基化的随机获得和丢失，源于细胞分裂过程中甲基化维持的不完美。在CG位点，这类表观突变可在植物中跨代遗传，并构成CG甲基化（mCG）多样性的主要来源。然而，mCG继承保真度在不同基因型间存在差异的原因，以及这种差异与稳态mCG水平之间的关系，仍知之甚少。研究人员在源自约70个拟南芥（Arabidopsis thaliana）Ler×Cvi重组自交系创始系的约400个突变积累系中，追踪了10代DNA甲基化。通过将甲基化获得率和丢失率作为数量分子性状，研究人员将一个主效位点定位到Cvi来源的VARIANT IN METHYLATION (VIM)2与VIM4之间的缺失，这两个基因是METHYLTRANSFERASE 1依赖性mCG维持通路的关键组分。携带该缺失的品系表现出VIM2/4（VIM2和VIM4）表达升高、全基因组mCG快速转向较低的稳态水平，以及跨代甲基化继承保真度降低。互补的过表达和功能缺失实验将VIM2/4鉴定为mCG维持的剂量敏感负调控因子，这与VIM家族蛋白在mCG中的经典正调控作用相反。总之，研究结果支持DNA甲基化组进化的间断平衡模型，在该模型中，自然分离的mCG稳态修饰因子可产生甲基化状态的突然转变，并改变植物基因组中可遗传表观遗传变异积累的速率。
DNA胞嘧啶甲基化是植物中重要的表观遗传修饰，参与转座子（TE）沉默、染色质组织和基因调控。自然群体中存在广泛的甲基化组变异，其中CG甲基化（mCG）由METHYLTRANSFERASE 1（MET1）和VARIANT IN METHYLATION（VIM）蛋白共同维持。尽管维持机制具有保真性，mCG状态仍会在细胞分裂和世代传递中发生随机获得和丢失，即自发表观突变。以往研究利用横断面甲基化数据进行数量性状位点（QTL）定位，但无法区分遗传变异是改变甲基化平衡态还是影响跨代保真度。Cvi-0是拟南芥中mCG水平全球最低的自然极端材料，其分子基础未知。研究人员构建了Ler×Cvi重组自交系（RIL）来源的突变积累（MA）群体，以解析mCG维持动态的遗传基础。该研究发表在《Nature Plants》。
研究方法上，研究人员以68个Ler×Cvi RIL为创始系，每个系建立8个独立MA家系，自交9代，共获得371个全基因组重亚硫酸盐测序（WGBS）数据集；利用AlphaBeta模型估算CG表观突变获得率（α）和丢失率（β），并基于WGBS数据构建包含732个SNP标记的高密度遗传图谱；结合QTL定位、RNA-seq、ATAC-seq、eQTL分析、PCR/qPCR及过表达和T-DNA插入突变体进行验证，并在自然Cvi居群和独立Col×Cvi RIL群体中验证。
**稳态mCG水平和表观突变率具有基因型依赖性**。重新分析850个拟南芥自然居群的甲基化组发现，mCG水平的变异程度约为非mCG的2.5倍。对4个代表基因型（Col-0、Kn-0、Mt-0、Tsu-0）的MA家系分析显示，mCG获得率和丢失率存在最高1.4倍差异，且由这些速率预测的平衡态与观测值一致，表明所有基因型均处于甲基化平衡态。
**MA作图群体的构建**。利用Ler×Cvi RIL构建了68个MA-ML家系，每个家系含8条独立谱系，连续自交9代。对早期（G2）和晚期（G9）个体进行WGBS，共371个数据集。通过WGBS数据鉴定SNP，构建了含732个标记的遗传图谱，平均间距1.3 cM，分辨率较原图谱显著提高。
**稳态mCG水平遗传中介的定位**。MA-ML中全球mCG水平在14.7%–21.3%之间变化，G2与G9间无显著差异，表明各系已处于稳态。以mCG水平为性状进行meQTL定位，在第1染色体鉴定到一个主效QTL，解释44%的表型变异，对基因体甲基化（gbM）基因影响最强（解释59%）；第2染色体存在一个影响TE、teM基因和基因间区mCG以及非CG甲基化的QTL。第1染色体Cvi等位基因主要降低Ler来源基因组区段中的mCG，且效应在世代间稳定。
**一个主效QTL调节自发性CG表观突变速率**。各RIL的表观突变速率差异达4.4倍（3.3×10
?4至14.5×10
?4）。QTL定位发现第1染色体同一主效位点同时影响α和β，对gbM区域丢失率解释64%的方差。第2、3、5染色体上的meQTL与表观突变速率无关。Cvi等位基因在Ler区段中同时增加获得和丢失率。RNA-seq和ATAC-seq分析未检测到明显的功能分化。
**第1染色体QTL含有一个与VIM2/4过表达相关的大片段缺失**。eQTL定位将VIM2/4（VIM2和VIM4）鉴定为QTL区间内的cis-eQTL。长读长组装比较发现Cvi特异性的约2.7 kb缺失位于VIM2与VIM4之间，删除了3个TE，包括一个强mCG甲基化的ATREP3元件。缺失与VIM2/4表达升高、mCG水平降低及表观突变速率升高显著相关。PCR和qPCR验证了缺失的分离和双基因上调。该缺失在自然Cvi居群和独立Col×Cvi RIL群体中均与mCG降低相关。
**VIM2/4是mCG维持的剂量敏感负调控因子**。在Col-0中过表达VIM2、VIM4或VIM24（两者同时）均导致全球CG低甲基化，mCG水平从野生型的29.1%降至最低8.0%，且对gbM区域的抑制强于TE。相反，vim2和vim4单突变体表现为CG高甲基化。这不同于VIM1/3的正调控作用。剂量反应呈非线性：极高表达（>1000倍）的品系mCG接近野生型。
**VIM2/4失调扰乱DNA甲基化通路**。VIM2/4与MET1、VIM1、VIM3、CMT3和ROS1等核心甲基化基因共表达。Cvi单倍型破坏了这种共表达网络，并下调ROS1。过表达系也下调VIM1、VIM3和ROS1，而vim2/4突变体则上调这些基因。ROS1通过MEMS-Helitron流变器对甲基化状态做出双向响应，但ROS1下调是VIM2/4扰动后的下游效应，不能解释全基因组CG低甲基化。
讨论部分指出，该研究将遗传扰动与mCG平衡和保真度的改变联系起来，支持间断平衡模型。研究者讨论了Shin等人提出的RNAi模型，但认为其
