烟草叶片提取物通过植物化学分析与分子对接展现协同抗氧化及抗癌活性

《Scientific Reports》：Nicotiana glauca leaf extract exhibits synergistic antioxidant and anticancer activities revealed by phytochemical profiling and molecular docking

　　

本研究旨在表征尼罗河三角洲公路沿线野生植物物种烟草（Nicotiana glauca Graham，茄科Solanaceae）的植物化学成分组成及其抗氧化、细胞毒性和分子对接特征。研究人员从2022年夏季采集的10种共发生野生植物物种的初步筛选中，基于其最高提取率（2.20%）、10个物种中最丰富的定性植物化学特征谱及其强抗氧化活性，选定烟草作为研究对象。随后，采用四种化学抗氧化测定法评估了烟草的水乙醇叶片提取物及其16个柱层析组分：2,2-二苯基-1-苦基肼（DPPH）、2,2′-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（ABTS）、高锰酸钾（KMnO?）和2,6-二氯酚靛酚（DCPIP）。综合植物化学表征采用薄层色谱（TLC）、TLC-生物自显影、傅里叶变换红外光谱（FTIR）、质谱、¹H和¹³C核磁共振（NMR）以及气相色谱-串联质谱（GC/MS/MS）分析。各提取物中总酚、总黄酮和总生物碱含量分别为0.3–8.4 g GAE/100 g干重（DW）、0.1–2.14 g/100 g DW和0.31–7.01 g/100 g DW；10个物种中这些化合物类别与抗氧化活性之间的Pearson相关性分析未达到统计学显著水平（p > 0.05），与测试浓度下的封顶效应一致，支持多种化合物类别共同而非单一类别对活性做出贡献。对组分11的GC/MS/MS分析显示，去氢烟碱（anabasine）为主要生物碱（39.26%），其次是去甲烟碱（nornicotine，36.50%）。分离并鉴定出两种纯化合物：N,N-亚甲基双(14-二十二碳烯)（化合物A）和14-甲基十六烷酸（化合物B）。粗提物与化合物A在抗氧化（联合指数，CI = 0.53）和抗癌活性（CI = 0.139–0.158）方面均观察到协同相互作用，而与化合物B则观察到拮抗效应（CI = 2.2–28.8）。粗提物和分离化合物对HeLa（IC?? = 146.04 μg/mL）和HepG2（IC?? = 169.38 μg/mL）癌细胞系均表现出浓度依赖性细胞毒活性。用化合物A处理HeLa细胞与促凋亡Bax基因上调、抗凋亡Bcl-2基因下调、Bax/Bcl-2比值升高以及丙二醛（MDA）水平升高相关，这些发现与凋亡诱导和氧化应激一致，但并非直接证据。分子对接分析表明，去氢烟碱与HPV16 E2（PDB：2Q79）和E6（PDB：7UAJ）癌蛋白具有有利的预测结合亲和力；这些计算结果为去氢烟碱抗HPV相关癌蛋白的进一步探索提供了假设生成的依据，并需实验验证。总体而言，这些发现将烟草表征为具有抗氧化和细胞毒性生物活性代谢物的有前景的野生来源，并支持进一步的机制和转化研究。

**论文解读：烟草叶片提取物的植物化学特征及其协同抗氧化与抗癌活性研究**

**一、研究背景与科学问题**

药用和芳香植物是全球生物多样性的重要组成部分，在医疗卫生和经济发展中扮演着关键角色。从植物来源分离具有药理潜力的生物活性化合物一直是新药研发的重要途径。然而，合成药物日益凸显的副作用问题使天然产物的研究重新受到重视。野生植物作为多种次生代谢物的重要来源，其复杂的化学组成和多样的生物活性为药物发现提供了广阔的资源库。其中，氧化应激被认为是多种急慢性疾病的共同病理基础，而能够中和活性氧的植物成分具有重要的治疗意义。尽管常规癌症治疗取得了一定进展，但耐药性和严重副作用问题仍然突出，从植物中发掘新型抗癌剂的需求十分迫切。

开发利用复杂植物提取物的关键挑战在于其成分间相互作用的复杂性。各成分间的协同或拮抗效应可通过联合指数（CI）框架进行量化，这对治疗方案优化至关重要。烟草（Nicotiana glauca Graham）隶属茄科（Solanaceae），俗称树烟草，原产于南美洲，已在地中海盆地干旱和半干旱地区广泛归化，包括埃及北部海岸和Wadi El-Natrun洼地。该物种积累哌啶类生物碱——主要为去氢烟碱，伴有去甲烟碱和烟碱等次要成分——构成其化学防御策略。此前对烟草的研究虽报道了其酚类、黄酮类含量及抗氧化、抗炎、抗菌和抗肿瘤等活性，但尚缺乏将比较性野生植物筛选、生物测定指导的分离纯化、联合指数定量分析、凋亡相关基因表达研究及分子对接探索整合于一体的系统性研究。因此，开展本项整合性研究具有重要的科学意义和应用价值。

**二、研究内容与主要结论**

本研究旨在系统表征烟草叶片提取物的植物化学组成，评估其抗氧化和抗癌活性，并阐明主要活性成分间的相互作用关系及潜在作用机制。研究人员从埃及北部海岸Wadi El-Natrun地区采集了10种共发生的野生植物物种，通过初步筛选确定烟草为最具研究价值的候选物种，其具有最高的提取率（2.20%）、最丰富的定性植物化学特征谱和强抗氧化活性。研究综合运用多种化学抗氧化测定法（DPPH、ABTS、KMnO?和DCPIP）、薄层色谱-生物自显影、傅里叶变换红外光谱、质谱、核磁共振和气相色谱-串联质谱等技术对提取物进行了全面化学成分表征。通过硅胶柱层析对烟草粗提物进行分级，获得16个柱层析组分，进而对最具活性的组分进行进一步分离纯化，获得两种纯化合物并鉴定其结构。研究还采用联合指数法量化了粗提物与分离化合物在抗氧化和抗癌活性方面的相互作用。

研究结果表明，烟草粗提物及其分离化合物对HeLa和HepG2癌细胞系表现出浓度依赖性细胞毒活性。值得注意的是，联合指数分析揭示了粗提物与化合物A在抗氧化（CI = 0.53）和抗癌（CI = 0.139–0.158）活性方面的显著协同效应，而与化合物B则呈现拮抗作用（CI = 2.2–28.8）。基因表达分析显示，化合物A处理HeLa细胞后，促凋亡基因Bax显著上调（5.133 ± 0.309倍），抗凋亡基因Bcl-2显著下调（0.309 ± 0.01倍），Bax/Bcl-2比值升高至对照的约16.6倍，同时丙二醛（MDA）水平显著升高。分子对接分析表明，去氢烟碱与HPV16 E2（PDB：2Q79）和E6（PDB：7UAJ）癌蛋白具有较好的预测结合亲和力。该研究发表在《Scientific Reports》，为烟草作为天然抗氧化和抗癌活性代谢物来源的开发利用提供了重要的科学依据，也为深入理解植物提取物中多组分协同作用机制奠定了基础。

**三、主要技术方法**

本研究综合运用了多种关键技术方法。在样本方面，研究人员于2023年8月从埃及Wadi El-Natrun地区沿亚历山大公路采集了10种野生植物新鲜样本，经开罗大学植物学与微生物学系分类学教授鉴定确认。提取物制备采用70%乙醇室温浸渍法。植物化学表征采用薄层色谱（TLC）、TLC-生物自显影、傅里叶变换红外光谱（FTIR）、质谱（MS）、¹H和¹³C核磁共振（NMR）以及气相色谱-串联质谱（GC/MS/MS）分析。抗氧化活性采用DPPH、ABTS、KMnO?和DCPIP四种化学测定法评估。抗癌活性采用MTT法检测HeLa、MCF7和HepG2三种癌细胞系。相互作用分析采用Chou-Talalay联合指数（CI）法。基因表达分析采用反转录PCR检测Bax和Bcl-2基因表达，MDA水平测定采用硫代巴比妥酸法。分子对接采用AutoDock Vina软件。

**四、主要研究结果**

**提取率与植物化学筛选**
对10种野生植物的乙醇提取物进行定性植物化学筛选，结果显示不同物种间次生代谢物的存在和相对丰度存在显著差异。烟草表现出最丰富的植物化学特征谱，对酚类、黄酮类、香豆素和鞣质等大多数筛选成分呈现强至极强的反应。定量分析显示，各提取物中总酚含量范围为0.80至117.19 g/100 g，烟草植物材料中生物碱含量最高（7.01 g/100 g），提取物中生物碱含量亦最高（2.71 g/100 g）。Pearson相关性分析表明，10个物种中酚类、黄酮类和生物碱含量与四种抗氧化测定法活性之间的12个相关性均未达到统计学显著水平（p > 0.05），与1000 μg/mL测试浓度下的封顶效应一致，支持多种化合物类别共同贡献于活性。

**抗氧化活性评价**
4种抗氧化测定法结果显示，所有提取物均表现出浓度依赖性抗氧化活性。在1000 μg/mL浓度下，单羽艾（A. monosperma）、绒花菊（T. hirsuta）、香丝草（E. bonariensis）和烟草的DPPH抑制率接近或超过99%。Zygophyllum arabicum在ABTS测定中活性最高（91.87%），烟草在KMnO?测定中表现优异。4种测定法之间存在强正相关性（ABTS与KMnO? r = 0.92；ABTS与DCPIP r = 0.93；DPPH与KMnO? r = 0.90）。薄层色谱-生物自显影分析显示烟草在所有供试植物中具有最丰富的抗氧化化合物。对烟草16个半纯化组分的活性评价显示，组分8–11为最有效的抗氧化组分，其中组分11在200 ppm下ABTS抑制率达87.17%。

**GC/MS/MS化学表征与化合物分离鉴定**
对组分11的GC/MS/MS分析揭示包含6种不同植物成分的复杂化学谱，主要成分为去氢烟碱（39.26%）、去甲烟碱（36.50%）、环己酮衍生物（10.02%）和Edetol（9.80%）。对组分11的亚组分进行进一步分离纯化，从亚组分1获得化合物A，经UV、IR、质谱、¹H-NMR和¹³C-NMR综合分析鉴定为N,N-亚甲基双(14-二十二碳烯)（C??H??N?，m/z = 662），从亚组分7经GC/MS/MS鉴定化合物B为14-甲基十六烷酸（C??H??O?，分子量270.5）。

**细胞毒性评估与联合指数分析**
细胞毒性结果显示，化合物B对HeLa细胞活性最强（IC?? = 70 μg/mL），其次为粗提物（IC?? = 150 μg/mL），化合物A活性最低（IC?? = 1000 μg/mL），HepG2细胞呈现类似趋势。各样品对MCF7细胞的活性均显著降低，表明细胞系特异性敏感性差异。参照药物多柔比星在相同条件下IC??值分别为HeLa 0.88 ± 0.02 μg/mL和HepG2 0.91 ± 0.04 μg/mL，确认了测定系统的敏感性。联合指数分析显示，粗提物与化合物A联合在HeLa（CI = 0.139）和HepG2（CI = 0.158）细胞中均呈强协同作用，而与化合物B联合则表现为拮抗（CI = 2.2）。化合物A本身并非最强的单独细胞毒剂，其重要意义在于作为粗提物植物化学矩阵中的关键协同伙伴。

**基因表达与氧化应激分析**
化合物A处理HeLa细胞后，促凋亡基因Bax显著上调（5.133 ± 0.309倍），抗凋亡基因Bcl-2显著下调（0.309 ± 0.01倍），Bax/Bcl-2比值从对照的约1.0升高至约16.6倍，这一结果与凋亡启动相符合。MDA水平测定显示，化合物A处理后MDA水平显著升高（14.868 ± 0.56倍，IC?? = 2.539 μM），提示化合物A与HeLa细胞中显著的氧化应激相关。这些发现与凋亡诱导和氧化应激机制一致，但需进一步实验验证。

**分子对接分析**
分子对接研究显示，去氢烟碱与2Q79（HPV16 E2）受体具有强且稳定的相互作用，结合能为?7.4638 kcal/mol，特征为去氢烟碱与Lys349和Ile350残基形成氢键，辅以Leu345的疏水相互作用。去氢烟碱与HPV16 E6（7UAJ）的结合能为?7.2349 kcal/mol，与HPV18 E6（6SJV）的结合能为?5.64 kcal/mol。对14-甲基十六烷酸和N,N-亚甲基双(14-二十二碳烯)的诱导契合对接揭示了靶标特异性依赖的构效关系：十四烷酸为E6癌蛋白的优化支架（与7UAJ结合能为?7.1 kcal/mol），而较长的二十二碳烯衍生物由于熵效应亲和力降低（?7.4 kcal/mol）；对于E2调节蛋白，14-甲基十六烷酸同样为优化支架（与2Q79结合能为?7.3 kcal/mol），而14-二十二碳烯需要采取能量不利的“卷曲”构象。两个化合物对HPV18 E6的亲和力均低于HPV16 E6。

**五、讨论与结论**

本研究的核心创新在于首次系统量化了烟草粗提物与其分离纯化合物之间在抗氧化和抗癌双重终点上的协同与拮抗相互作用。研究发现粗提物的生物效力无法单独由任一分离化合物完全解释，而是依赖于与化合物A的协同作用（抗氧化CI = 0.53；抗癌CI = 0.139–0.158），这一关系在以往对烟草的研究中未见报道。将这种协同效应与特定机制读出（Bax/Bcl-2调节和MDA升高）联系起来，并将该物种主要生物碱对HPV癌蛋白靶标的计算对接评估相结合，进一步使本研究的整合方法区别于以往对烟草的单终点研究。

安全考虑方面，烟草积累去氢烟碱为其主要生物碱，该化合物具有充分记载的毒性，包括摄入烟草叶片后发生致命性人体中毒的案例。生物活性剂量与毒性剂量之间的窄安全范围是未来任何转化开发的重要考量。选择性指数研究以及体内毒理学评价应在体内工作之前开展。

研究局限性包括：凋亡仅依据Bax/Bcl-2基因表达推断，需Annexin V/PI、caspase-3/7活性、PARP裂解或TUNEL染色进行直接确认；氧化应激仅通过脂质过氧化生物标志物MDA间接评估，需DCFDA荧光等直接胞内ROS测量；分子对接结果仅为计算结合预测，需结合测定或共结晶等实验验证；所有生物测定均在体外进行，体内功效、药代动力学和毒性尚待评估。

**研究结论**
本研究将野生植物烟草（从十物种筛选中基于高提取率和植物化学丰富度选定）表征为具有生物活性的抗氧化和细胞毒性代谢物来源。其主要分离化合物N,N-亚甲基双(14-二十二碳烯)（化合物A）单独存在时并非最有效的细胞毒或抗氧化剂，而是作为关键协同伙伴，显著增强粗提物的抗氧化和抗癌活性（CI分别为0.53和0.139–0.158），而14-甲基十六烷酸（化合物B）则拮抗该活性。化合物A处理HeLa细胞与Bax/Bcl-2比值升高和MDA水平升高相关，这些发现与凋亡诱导和氧化应激一致，但并非直接证据。分子对接提示去氢烟碱（提取物的主要生物碱）与HPV16 E2和E6癌蛋白具有有利的预测结合亲和力，该计算发现需实验确认。未来工作应优先开展：凋亡和氧化应激的直接确认；去氢烟碱-HPV癌蛋白对接预测的实验验证，理想情况下应包含与HPV18癌蛋白结构的对接；粗提物、化合物A和富含去氢烟碱组分的选择性指数及体内毒性评价；以及探索是否可通过低生物碱组合重现或增强提取物的协同活性，作为更安全转化开发的一步。