Yellow蛋白被募集用于维持叶甲中的专性共生

《Nature Communications》：Yellow protein co-opted to sustain obligate symbiosis in leaf beetles

　　

Yellow蛋白家族在昆虫中最为人所知的功能涉及色素沉着、行为和发育。本研究揭示了一个引人注目的进化新功能：维持龟甲中一段古新世起源的消化共生关系。研究人员证明，一种雌性特异性Yellow蛋白形成凝胶状球体，在垂直传播过程中包封细菌Stammera，使其尽管拥有大幅缩减的基因组（0.24 Mb）和有限的代谢能力，仍能在胞外存活。Yellow表达高度局限于卵巢中携带共生菌的腺体，在该处蛋白被组装成基质并在产卵时分泌。yellow的功能敲降会破坏球体完整性，并在干燥条件下损害共生菌存活能力，凸显该蛋白对Stammera的包埋特性和保护作用。这些发现揭示了一个古老基因家族的新功能，并展示了龟甲如何重新利用Yellow蛋白，以克服其共生菌在胞外传播过程中面临的极端代谢限制。

Yellow蛋白家族最早在果蝇色素沉积研究中被发现，已知广泛参与昆虫色素形成、行为、发育、免疫和应激响应。龟甲类昆虫（Coleoptera: Chrysomelidae: Cassidinae）与基因组长约0.24 Mb的专性共生菌Candidatus Stammera capleta形成古新世起源的消化共生。Stammera基因组高度缩减，但仍编码并分泌植物细胞壁降解酶，帮助寄主消化果胶和纤维素等难降解多聚物。与许多胞内共生菌不同，Stammera在龟甲卵帽的球形分泌物中以胞外方式垂直传播，并需在胚胎最终获得前胞外存活约11天。此前，这些卵关联球体的分子组成及其保护机制尚不清楚。该研究发表于《Nature Communications》，揭示了Yellow蛋白家族一个此前未知的功能：作为胞外共生菌的包埋基质，维持专性共生关系的稳定传递。

研究人员首先对Chelymorpha alternans开展了HiFi长读长基因组测序和注释，并通过前肠共生器官与卵巢相关腺体的比较转录组分析，筛选出在传播器官中高表达的Yellow蛋白候选基因。随后利用SDS-PAGE和液相色谱-质谱联用（LC-MS）确认Yellow是含菌球体的主要蛋白成分。通过RT-qPCR、免疫荧光定位和免疫金电镜，研究人员明确了Yellow在卵巢相关腺体中的表达与分泌模式，并观察其在卵帽中包绕Stammera形成片层基质。利用RNA干扰（RNAi）敲降yellow后，球体形态异常、卵帽中Yellow缺失，并在低湿度条件下导致Stammera滴度显著下降和转录崩溃。研究还结合系统发育、共系统发育、选择压力分析和AlphaFold结构预测，评估了Yellow在多种龟甲中的分子进化特征。

主要关键技术方法包括：HiFi长读长基因组测序与基因组注释；组织特异性比较转录组与差异表达分析；SDS-PAGE和LC-MS蛋白质组鉴定；RT-qPCR和荧光原位杂交（FISH）；免疫荧光和免疫金电镜；AlphaFold结构预测与根均方差（RMSD）分析；Fixed Effects Likelihood（FEL）选择压力分析；双链RNA介导的RNAi功能敲降；低湿度胁迫实验与双RNA-seq。物种样本包括实验室饲养的C. alternans，以及来自巴拿马、德国等地的Chelymorpha bullata、Chelymorpha gressoria、Acromis sparsa、Charidotella sexpunctata、Cassida rubiginosa和Aspidimorpha quinquefasciata等6种其它龟甲。

研究结果如下：

龟甲在传播过程中将Stammera包埋于Yellow。通过比较转录组鉴定出卵巢相关腺体中显著高表达的yellow基因，SDS-PAGE和LC-MS证实该Yellow蛋白是含菌球体的主要成分。

Yellow表达局限于卵巢相关腺体。RT-qPCR显示yellow仅在雌性卵巢相关腺体中高表达，雄性组织无表达；免疫定位和免疫金电镜显示Yellow在腺体内组装为基质并分泌至卵帽，包绕Stammera形成片层状球体结构。

Yellow在龟甲中的分子进化。基于7种龟甲的比较分析表明，Yellow属于Yellow-x分支，其C端六片层β-propeller结构域高度保守并受纯化选择，N端无序区富含正选择位点；Yellow与Stammera的系统发育关系高度一致，支持寄主与共生菌的共多样化。

Yellow沿卵巢相关腺体的表达。通过分段分析发现，成熟雌性中yellow表达集中于近端Segment 1和Segment 2，而Stammera丰度在远端Segment 3最高，表明共生菌增殖与Yellow介导的包封过程在空间上解偶联。

一个新的共生球体储存器官。研究人员发现并描述了一对位于卵巢相关腺体下方的球囊状结构，该器官仅储存已形成的含菌球体，不表达yellow，提示其作为垂直传播前的临时储存场所。

功能敲降证实Yellow在共生菌包封中的结构作用。RNAi敲降yellow后，Stammera仍可存在于寄主组织中，但球体形态变得不规则、卵帽中Yellow涂层缺失，证明Yellow对基质完整性和球体形态至关重要。

Yellow是共生菌在非生物胁迫下稳定性所必需。在低湿度条件下，yellow敲降雌性所产卵中Stammera滴度显著下降；双RNA-seq显示Stammera的rpoC基因显著下调，整体转录活性降低，说明Yellow通过缓冲干燥胁迫保护共生菌的转录和代谢功能。

讨论部分指出，Yellow作为胞外支架的作用与蜜蜂中的major royal jelly protein 1（MRJP1）形成凝胶基质的功能相似；椿象等昆虫中也存在将odorant-binding protein或mucin样糖蛋白募集为共生菌保护性支架的案例，提示这是昆虫应对外源共生传播胁迫的趋同策略。Yellow与Stammera的系统发育一致性提示长期共多样化。研究结论可概括为：在龟甲中，一个雌性特异性yellow基因编码糖基化的、可形成基质的蛋白，构成垂直传播期间包埋Stammera的球体。干扰yellow会损害基质完整性，破坏球体形态，降低干燥条件下共生菌存活率，并引发以rpoC下调为标志的Stammera转录崩溃。Yellow因此被确立为龟甲胞外共生传播中的关键支架蛋白，将Yellow蛋白家族的功能从色素沉着、行为和免疫拓展到共生菌稳定化。