WTAP介导的m6A RNA甲基化在负压伤口治疗下促进糖尿病足溃疡愈合

《Journal of Diabetes Investigation》：WTAP-mediated m6A RNA methylation promotes diabetic foot ulcer healing under negative pressure wound therapy

　　

目的：探讨RNA N6-甲基腺苷（m⁶A）甲基转移酶Wilms肿瘤1相关蛋白（WTAP）在负压伤口治疗（NPWT）治疗糖尿病足溃疡（DFU）中的作用。

材料与方法：研究人员纳入46例DFU患者和16例接受NPWT的非糖尿病慢性溃疡患者。在NPWT前后检测创缘组织中总m⁶A水平及甲基转移酶（METTL3、METTL14和WTAP）的表达。利用高糖诱导的HaCaT和HDF细胞模型，配合体外负压系统，评估负压对WTAP表达的影响以及WTAP改变对细胞功能的影响。

结果：NPWT前，DFU患者的METTL3、METTL14、WTAP和m⁶A水平显著低于非糖尿病慢性溃疡患者。NPWT一周后，这些参数在两组中均显著升高，且WTAP与m⁶A水平呈正相关。值得注意的是，WTAP表达的增加与DFU患者4周愈合结局呈显著正相关。体外实验中，负压显著逆转了高糖诱导的HaCaT和HDF细胞中WTAP的下调，而WTAP敲降严重损害了其增殖和迁移。

结论：NPWT与DFU愈合改善及WTAP-m⁶A水平恢复相关，其效应可能与负压促进WTAP表达以增强创面细胞增殖和迁移有关。

该论文发表于《Journal of Diabetes Investigation》，围绕WTAP介导的m⁶A RNA甲基化在负压伤口治疗（NPWT）促进糖尿病足溃疡（DFU）愈合中的作用展开。

研究背景方面，糖尿病已成为全球重大公共卫生问题，2024年全球成人糖尿病患者达5.89亿，预计2050年将增至8.53亿。DFU是糖尿病的严重并发症，终身发病率达19%–34%，一年内复发率约40%，截肢后五年死亡率超过70%。DFU的发病机制涉及糖尿病周围神经病变和外周动脉疾病，持续高血糖导致慢性炎症、血管生成受损、再上皮化延迟和细胞外基质重塑紊乱，使创面陷入长期不愈状态。目前临床治疗DFU的方法包括血糖控制、血管重建、清创、NPWT和感染控制，但加速溃疡愈合和降低高复发率仍是重大挑战。NPWT通过引流渗出液、减轻创周水肿、改善局部血流和清除细菌，在临床上可缩短DFU愈合时间、减小溃疡面积并降低截肢率，但其深层分子机制尚不清楚。N6-甲基腺苷（m⁶A）是常见的RNA表观遗传修饰，由包含METTL3、METTL14和WTAP的甲基转移酶复合物催化。WTAP虽无催化活性，但对招募复合物至靶RNA至关重要。已有研究显示，糖尿病小鼠创缘皮肤中总m⁶A水平和WTAP表达显著降低，且WTAP可调控角质形成细胞增殖。然而，NPWT如何改变WTAP表达以及WTAP是否通过m⁶A甲基化影响糖尿病创面愈合仍不清楚。因此，该研究旨在初步探索WTAP-m⁶A通路与NPWT加速DFU愈合之间的潜在关联。

在研究方法上，研究人员于安徽医科大学第一附属医院纳入46例DFU患者和16例非糖尿病慢性下肢溃疡患者（皮肤溃疡对照组，SUC），均接受NPWT一周；另回顾性纳入8例仅接受常规清创治疗的DFU患者作为对照。主要技术方法包括：用qRT-PCR和Western blot检测创缘组织中WTAP、METTL3、METTL14的mRNA和蛋白表达；用比色法定量总RNA m⁶A水平；用免疫组化（IHC）检测WTAP蛋白分布及平均光密度。细胞实验采用高糖诱导的HaCaT（人永生化角质形成细胞）和HDF（人真皮成纤维细胞）模型，配合体外负压装置施加?125 mmHg压力24小时，并通过siRNA敲降WTAP，结合CCK-8、划痕愈合和Transwell实验评估细胞增殖和迁移能力。

研究结果分为以下几个部分。第一，DFU与SUC组基线临床和实验室数据比较显示，DFU患者较SUC组具有更低的BMI、红细胞、血红蛋白、红细胞压积、白蛋白、总胆固醇和估算肾小球滤过率，以及更高的空腹血糖、糖化血红蛋白、C反应蛋白、白细胞、凝血酶原时间、活化部分凝血活酶时间、纤维蛋白原、乳酸脱氢酶和肌酐，提示DFU患者存在更差的营养状态和更明显的炎症、高凝状态。第二，DFU组织中m⁶A甲基化和甲基转移酶表达降低，且WTAP正向预测m⁶A水平。治疗前，DFU创缘组织的总m⁶A百分比显著低于SUC组，WTAP、METTL3、METTL14的mRNA和蛋白表达均明显下调。Pearson相关分析显示，m⁶A水平与WTAP表达在DFU（r=0.484）和SUC（r=0.877）组均显著正相关，而METTL3和METTL14与m⁶A无显著相关；回归模型进一步证实WTAP是m⁶A的正向预测因子。第三，NPWT后m⁶A甲基化和甲基转移酶表达增加，且ΔWTAP正向预测Δm⁶A%。治疗一周后，两组创缘组织的m⁶A%、WTAP、METTL3和METTL14均较基线显著升高，IHC也证实WTAP蛋白增加。回顾性对照分析显示，仅接受常规清创的DFU患者治疗一周后WTAP的免疫组化平均光密度无显著变化，提示WTAP上调与NPWT相关。动态变化分析显示，Δm⁶A%与ΔWTAP在DFU（r=0.592）和SUC（r=0.674）组均显著正相关，ΔWTAP可正向预测Δm⁶A%。第四，基线WTAP表达与METTL3/14及临床指标的相关性方面，WTAP mRNA与METTL3表达在两组均正相关（DFU r=0.499，SUC r=0.691），并与糖尿病病程正相关（r=0.457），但与METTL14及多数临床指标无显著相关。第五，4周愈合结局与ΔWTAP及临床特征的相关性分析显示，在DFU组，ΔWTAP与4周愈合结局显著正相关（r=0.398），而较高的糖化血红蛋白、较高的Wagner分级以及截肢发生与4周愈合结局显著负相关（r分别为?0.473、?0.442、?0.581）。SUC组中男性与4周愈合正相关。第六，体外实验表明，负压可逆转高糖诱导的WTAP表达抑制。高糖环境显著抑制HaCaT和HDF细胞中WTAP的mRNA和蛋白表达，而?125 mmHg负压处理24小时显著增加WTAP表达，并有效逆转高糖引起的WTAP下调。第七，WTAP敲降加重高糖诱导的角质形成细胞和成纤维细胞增殖与迁移损伤。在正常糖和高糖条件下，转染WTAP siRNA均能显著降低WTAP表达。功能实验显示，高糖本身降低细胞活力、迁移能力和划痕愈合率，而WTAP敲降进一步加剧这些损伤，表明WTAP对于维持创面细胞增殖和迁移至关重要。

在讨论部分，研究人员指出DFU由代谢紊乱、周围神经病变和血管疾病共同驱动，本研究中DFU患者常伴有肾功能受损、营养不良、全身炎症和高凝状态，提示临床需综合管理。越来越多的证据表明m⁶A甲基化参与糖尿病创面愈合的多个病理过程。本研究的创新点在于发现WTAP是NPWT期间m⁶A水平变化的主要调控因子，而非METTL3或METTL14，且WTAP上调幅度与早期愈合相关。体外实验进一步证实负压逆转高糖诱导的WTAP下调，WTAP敲降损害细胞功能。因此，NPWT可能通过恢复WTAP表达和m⁶A甲基化，增强创面角质形成细胞和成纤维细胞的增殖与迁移，从而加速DFU愈合。局限性包括常规治疗对照组样本量小且为回顾性设计、单中心研究、未明确下游靶RNA，未来需要更大规模的前瞻性多中心研究和多组学分析。

研究结论为：DFU组织中WTAP表达和总m⁶A水平显著降低且强正相关；NPWT可有效恢复两者，WTAP上调幅度可正向预测m⁶A升高，并与早期溃疡愈合显著正相关；体外实验证实负压逆转高糖诱导的WTAP下调，而高糖环境通过下调WTAP损害角质形成细胞和成纤维细胞的增殖与迁移。综上所述，NPWT加速DFU愈合与恢复WTAP介导的m⁶A RNA甲基化密切相关，进而影响创面细胞的关键功能。