基于乙酰胆碱酯酶活性与RGB图像分析的便携式纸基比色生物传感器用于有机磷暴露的快速筛查

《Biosensors》：Portable Paper-Based Colorimetric Biosensor for Rapid Screening of Organophosphate Exposure via Acetylcholinesterase Activity and RGB Image Analysis

　　

背景：快速筛查乙酰胆碱酯酶（AChE）抑制对于监测有机磷化合物暴露至关重要，特别是在实验室基础设施有限的外场环境中。本研究旨在开发一种便携式纸基比色生物传感器，用于半定量检测血液样本中的AChE活性。方法：该传感器基于pH依赖性颜色变化，改良自改良Edson法。该平台首先通过实验模型进行优化，随后在真实现场条件下采集的人毛细血管血样本中进行了评估。参考血清胆碱酯酶活性由认证临床实验室测定，并与传感器的比色响应进行比较。对部分样本进行了RGB（红、绿、蓝）图像分析，以数字化表征该设备的显色响应。结果：AChE活性未受抑制的样本表现出与底物水解相关的可见颜色变化，而活性降低或受抑制的样本则保持以深蓝为主的色调。人体样本的RGB分析显示，AChE活性与R和G通道之间存在显著关联，支持该平台区分与不同酶活性范围相关的显色模式的能力。结论：所提出的平台证明了将基于pH的AChE测定转化为便携式纸基形式用于半定量视觉和RGB辅助筛查的可行性。其在人体样本中的评估证明了作为概念验证在实际现场条件下使用的可行性。需要进一步研究以优化其分析性能，并在更大和更多样化的人群中验证其应用。

论文解读：便携式纸基比色生物传感器用于有机磷暴露快速筛查

农业是全球重要的生产活动，有机磷（OP）农药因高效杀虫能力而被广泛应用，但其长期和不合理使用带来了职业与环境暴露风险，尤其在依赖农业的南美地区。智利Maule地区以水果种植为主要经济活动，当地人群可能通过直接接触或环境污染而暴露于OP化合物，进而出现神经、内分泌和生殖系统损害。常规检测OP残留的方法如气相或液相色谱-质谱联用虽灵敏，但需要专业设备、集中化实验室和较长分析时间，不适合田间现场监测。因此，开发简单、快速、低成本的现场筛查工具具有重要意义。OP的毒性机制主要是抑制乙酰胆碱酯酶（AChE），基于AChE活性的比色法可通过底物水解引起的pH变化间接评估酶活性。本研究在Edson法经Limperos和Ranta改良的基础上，将传统实验室比色测定转化为便携式纸基平台，并结合RGB数字图像分析，用于指尖毛细血管全血的AChE活性半定量筛查。该研究发表于《Biosensors》。

研究人员首先在大鼠模型（雄性Sprague-Dawley大鼠，体重250–300 g）中通过腹腔注射地嗪农（10 mg/kg）建立有机磷暴露对照，并在试管及96孔微板中优化了改良Edson–Limperos比色反应。随后将该反应体系转移至不同纸基材料上，选择Whatman LF1纸制作试纸条。人体验证阶段纳入了来自智利Maule地区San Rafael和Curicó两市的68名参与者，现场采集指端毛细血管全血直接滴加于试纸条进行原位分析；由认证临床实验室（Laboratory Loncomilla?，智利Talca）使用Roche Cholinesterase Gen.2法测定血清胆碱酯酶活性作为参考标准。对35个满足图像质量要求的样本，使用ImageJ软件提取反应区域的RGB通道强度值，并与参考酶活性进行关联分析。

3.1 基于改良Edson–Limperos法的比色传感原理验证。研究人员在试管中同时评估了乙酰胆碱碘化物（AChI）和乙酰胆碱高氯酸盐（AChClO4）作为底物。结果显示，未受抑制的血清样本在底物水解后出现明显的颜色变化，从蓝色（pH 7.2）变为绿色至黄色；而地嗪农处理动物的血清及阴性对照保持蓝色。两种底物表现相当，但AChClO4产生更易区分的颜色转变，因此被选用于后续实验。这验证了该比色原理能够有效检测AChE抑制。

3.2 比色传感平台的微量化优化。将反应体积缩小至96孔板，以10 μL血清与溴百里酚蓝（BTB）和AChClO4混合。微量化结果与试管法一致：具有活性的样本在20分钟内发生从蓝到绿/黄色的变化，而地嗪农处理样本和阴性对照仍为蓝色。微量化并未损害系统区分保护与抑制状态的能力，且10 μM AChClO4被选为工作浓度，为后续纸基装置开发奠定了降体积基础。

3.3 纸基传感器的制作与优化。比较了滤纸、Whatman LF1纸、色谱纸和硝酸纤维素膜等不同纸基材料。LF1纸展现出持续而均匀的血清毛细迁移能力，能够清晰分离血细胞与血清成分，并在添加试剂后形成均匀的蓝色反应区。这种纸基材料被选为试纸条基底，使样本处理、酶反应和视觉读出可集成于单一平台。

3.4 基于人体毛细血管血样本的纸基传感器验证。对68名参与者的现场检测中，男性与女性的血清胆碱酯酶活性存在显著差异（p = 0.0223），而年龄与酶活性无显著相关。根据参考实验室结果，样本被分为<7000 U/L、7000–10,000 U/L和>10,000 U/L三组。35个样本的RGB分析显示，R通道（R² = 0.128，p = 0.035）和G通道（R² = 0.121，p = 0.041）与酶活性显著相关，而B通道无显著关系（R² = 0.001，p = 0.828），表明RGB信号可用于区分不同酶活性的显色模式。

3.5 受控实验条件下的RGB比色分析。在大鼠地嗪农暴露模型中，给药前（0 min）的血样经试纸条反应后呈现蓝绿色调，绿色通道贡献相对较高；给药后30 min的血样因AChE被抑制，反应区保持深蓝色，绿色通道相对减弱、蓝色通道占优势。RGB定量分析可检测出这种由酶抑制引起的通道比例变化，说明该平台结合数字图像分析可以实现客观的半定量监测。

讨论部分指出，该平台并非用于测定经典酶动力学参数，而是通过pH依赖的颜色变化提供功能性读出，适用于区分保留和受抑制的AChE活性。纸基材料的选择对毛细流动和信号均匀性至关重要；AChI与AChClO4的相似响应可归因于胆碱阳离子是AChE识别的功能部分，而阴离子不影响催化。在人体样本中，RGB信号与酶活性虽有显著关联，但决定系数较低，可能受血细胞比容、血红蛋白光学干扰和个体差异等因素影响。因此，该装置定位于现场或资源有限环境中的初步筛查工具，而非替代常规实验室检测。未来需优化信号标准化、改进图像采集条件，并在更大规模人群中验证诊断性能。结论部分翻译为：基于pH的比色测定可在不同生物基质中可重复地检测AChE活性及其抑制。反应微量化使其成功转化为纸基形式，同时保留了区分保留与受抑制AChE活性的能力。结合具有受控毛细流动性能的纸基材料，该平台产生了半定量响应，可通过RGB辅助数字分析进一步表征。综上所述，这些发现证明该平台作为视觉和RGB辅助筛查AChE活性的初步概念验证是可行的。该测定成功转化为微型化格式，且与数字图像分析兼容，并在人体样本中完成评估，这突显了其在实验室基础设施受限的即时检测和低资源应用中的潜在实用价值。