《Pharmaceutics》：From Antimicrobial Activity to Topical Translation: An Integrated Framework for Testing, Cytotoxicity Assessment and Formulation of Plant Extracts, Essential Oils and Honey
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背景/目的：SARS-CoV-2变异株的快速出现可逃避中和抗体，这凸显了对新型抗病毒生物制品的需求，该类制品需将精确的分子设计与可规模化、成本效益高的生产工艺相结合。经计算设计的靶向刺突蛋白受体结合域（receptor-binding domain, RBD）
背景/目的：SARS-CoV-2变异株的快速出现可逃避中和抗体，这凸显了对新型抗病毒生物制品的需求，该类制品需将精确的分子设计与可规模化、成本效益高的生产工艺相结合。经计算设计的靶向刺突蛋白受体结合域（receptor-binding domain, RBD）的微型蛋白（miniprotein），因其尺寸小、热稳定性高以及与微生物表达系统兼容等优势，为单克隆抗体提供了一种颇具前景的替代方案。在此，研究人员详述了IPD-52520的完整开发及cGMP生产全过程。IPD-52520是一种新型抗病毒微型蛋白，采用优化的大肠杆菌（E. coli）平台生产。方法：两种候选微型蛋白——同源三聚体构建体（Trimer，IPD-52520，17 kDa）和串联融合构建体（Daisy，IPD-52521，25 kDa）——通过菌株选择、培养基配方、补料分批发酵、包涵体溶解、复性和色谱纯化的系统性优化，以平行方式进行了评估。领先候选药物在cGMP条件下从5 L放大至50 L，并进行了生物物理及稳定性分析，以支持非临床和I期临床开发。结果：Trimer基于优异的临床前疗效、良好的药代动力学特征和更高的体积产率被选为领先分子。优化后工艺的纯化蛋白产率约为2 g/L，纯度超过90%。从5 L至50 L的放大在六次独立运行中展现出优异的批次一致性。生物物理研究确认其为折叠良好、以α-螺旋为主的三聚体（Tm = 73.4 °C；多分散性 = 1.005），具有完整的一级结构和强靶点结合能力（KD < 1 pM）。稳定性研究表明，该药物在2–8 °C下至少可稳定保存12个月，长期稳定性研究正在进行中。结论：这些研究结果表明，经计算设计的抗病毒微型蛋白可以转化为可规模化的生物制品，并为针对当前及未来大流行的快速治疗开发建立了平台。
**论文解读：计算设计的抗病毒微型蛋白IPD-52520的cGMP开发与转化**
**1. 研究背景与存在问题**
COVID-19大流行暴露了全球准备方面的关键缺口：无法快速设计、生产和大规模部署有效的抗病毒生物制品。SARS-CoV-2的持续进化已削弱了感染或疫苗接种所诱导的中和抗体的效力，使许多单克隆抗体疗法对新兴变异株失效。这些挑战凸显了对新一代抗病毒药物的迫切需求，该类药物需兼具分子精确性与快速、可规模化且经济高效的生产能力。人工智能、计算蛋白设计和实验验证的结合使得从第一性原理工程化新型蛋白质成为可能。微型蛋白（miniprotein），即通常由40–80个氨基酸组成的小型结构化蛋白，作为一种有前景的治疗模式，填补了单克隆抗体与小分子药物之间的空白。其小尺寸增强组织渗透，优异的热稳定性消除冷链需求，与微生物表达系统的兼容性降低了生产复杂性。然而，尽管微型蛋白设计算法可以生成高亲和力结合物，但其生产的稳健、可规模化生物工艺开发却鲜受关注，这构成了计算设计与可制造治疗药物之间的关键缺口。
**2. 研究目的与技术方法**
针对上述问题，研究人员开展了一项综合研究，旨在建立从表达优化到cGMP放大的完整框架，以支持计算设计的抗病毒微型蛋白的临床转化。研究采用了以下关键方法：①候选微型蛋白构建体的平行评估，包括同源三聚体Trimer（IPD-52520，17 kDa）与串联融合Daisy（IPD-52521，25 kDa）；②基于摇瓶筛选和5 L补料分批发酵的大肠杆菌菌株选择（涵盖BL21(DE3)、C41(DE3)、C43(DE3)等六种菌株）；③培养基优化（对比RRTBII与SY培养基）及补料策略开发（pH-stat补料与手动泵控制比较）；④包含盐酸胍溶解、切向流过滤（TFF）复性、阴离子交换色谱（AEX）、疏水相互作用色谱（HIC）及超滤/透析（UF/DF）在内的下游纯化工艺开发；⑤内毒素清除策略优化（聚乙烯亚胺PEI沉淀、Tergitol清洗）；⑥cGMP条件下的50 L规模放大及六批次生产，以及⑦全面的生物物理表征（SEC-MALS、DSC、CD、LC-MS/MS）和稳定性研究。研究在SK bioscience的设施中完成从细胞库建立到cGMP生产的全过程。
**3. 研究结果**
**3.1 菌株选择（Strain Selection）** ：通过摇瓶筛选和5 L补料分批发酵比较，证实BL21(DE3)是最优生产菌株，其对Trimer和Daisy的表达均优于C41(DE3)和C43(DE3)，且表达一致性最佳。
**3.2 培养基与补料策略优化（Media and Feeding Strategy Optimization）** ：SY培养基与RRTBII相比，诱导时间更早（26.0小时对33.0小时）、最终细胞密度相当，且配方更简单，有利于工业生产。pH-stat补料策略较手动泵控制使细胞沉淀产量增加57%，而200 g/L葡萄糖的标准补料培养基优于500 g/L高浓度配方。
**3.3 工艺参数与表达优化（Process-Parameter and Expression Optimization）** ：初始葡萄糖浓度为10 g/L可最佳平衡生长动力学与工艺效率；通气量4.0 SLPM优化了生长速率与表达产量之间的平衡；晚期诱导（OD600约74）显著优于早期诱导（OD600约4）；1 mM IPTG浓度为最优；诱导后6–8小时即可达到最大表达。
**3.4 回收方法优化（Recovery Method Optimization）** ：比较了热裂解、微流化、渗透裂解和胍裂解四种方法。结果表明两种微型蛋白在大肠杆菌中主要以包涵体形式存在，因此选择盐酸胍进行包涵体溶解，6 M盐酸胍可实现Trimer的完全溶解。5倍缓冲液体积（相对于细胞沉淀重量）可在保持产量的同时减少工艺体积。
**3.5 复性与色谱纯化（Refolding and Chromatographic Purification）** ：TFF透析过滤在完全去除变性剂和降低缓冲液消耗方面优于稀释复性。在阴离子交换树脂筛选中，DEAE-FF表现最佳，具有更高的步骤产率（50.5%）和更好的杂质去除能力。UF/DF（30 kDa MWCO膜）将纯度从约75–85%提高到90%以上，主要去除低分子量（LMW）物质。
**3.6 内毒素去除（Endotoxin Removal）** ：0.05% PEI在有效降低内毒素的同时保持蛋白质回收率；随后使用内毒素去除树脂，将内毒素水平从160–210 EU/mg降至20–30 EU/mg（去除效率86–88%）。
**3.7 放大确认（Scale-Up Confirmation）** ：从1 L到10 L的放大表现出良好的可重复性。Daisy产量为1.7–2.0 g/L，纯度94.4–98.7%；Trimer产量为2.5–2.9 g/L，纯度93.1–95.8%。
**4. 讨论与结论**
**4.1 讨论总结**
在讨论部分，研究人员对工艺开发的关键决策进行了深入分析。发酵工艺方面，选择BL21(DE3)符合其在重组蛋白生产中的公认有效性，SY培养基简化了配方且降低原料成本。pH-stat补料策略利用碳源消耗过程中pH的自然下降自动控制营养物供给，使细胞沉淀质量增加57%。延迟诱导（OD600≥60）和6–8小时诱导时间可最大化蛋白生产机制并减少包涵体形成。回收与纯化方面，可溶性蛋白回收方法的较差表现证实了包涵体主导的形成模式，因此转向基于胍的溶解策略。TFF复性提供了优异的工艺控制并大幅减少缓冲液消耗。DEAE-FF树脂因高动态结合容量（50 mg/mL）、良好步骤产率（>50%）和有效杂质清除而被选为最优色谱介质。多种正交色谱模式无法有效分离高分子量（HMW）杂质表明这些污染物可能是部分聚集或错误折叠的产物形式。工艺进化方面，研究人员引入了三种单元操作以强化内毒素清除：HIC精纯步骤、复性后第二次PEI添加以及AEX柱的Tergitol清洗（浓度从1%优化至3%）。3% Tergitol条件下的确认运行使药物原液满足所有拟定规格，包括内毒素限量。双阶段内毒素控制策略（溶解时PEI处理及下游精纯）实现了稳健的内毒素清除。整体工艺（胍溶解、TFF复性、单步AEX、UF/DF和内毒素去除）有意精简，最小化了基础设施复杂性，支持高效技术转移，并适用于规模化生产。工艺实现约2 g/L的体积产率、超过90%的纯度，处于微生物系统小分子重组蛋白的高性能预期范围内。Trimer因优异的临床前疗效（同源三聚体构象实现亲和力驱动的靶点结合）、更有利的药代动力学特征（17 kDa小分子足迹）以及更高的生产滴度（2.5–2.9 g/L对比1.7–2.0 g/L）和更强的工艺稳健性，被选为领先候选药物并进入cGMP临床材料生产。cGMP放大方面，八批独立生产证明批次间可比性优异，无规模化相关趋势。
**4.2 研究结论**
本研究展示了IPD-52520的全流程开发、cGMP生产、表征和稳定性评估。关键成果如下：（1）系统化的发酵优化方法，建立了稳健的E. coli BL21(DE3)工艺，采用简化SY培养基、pH-stat补料和晚期诱导策略，缩短了工艺时间同时最大化表达；（2）精简的回收与纯化平台，包括胍溶解、TFF复性、单柱AEX、UF/DF和双阶段内毒素去除，以最小设施需求实现约2 g/L产量和>90%纯度；（3）成功放大至50 L cGMP规模，八批独立批次表现出优异的可比性，支持非临床毒理学和I期临床供应；（4）全面的生物物理表征，确认为折叠良好、热稳定（α-螺旋含量85.4%；Tm 73.4 °C）、单分散的微型蛋白，具有完整一级结构和皮摩尔级靶标结合亲和力；（5）支持2–8 °C下至少12个月储存的稳定性特征，稳定性研究仍在进行中。这些结果证明了计算设计的抗病毒蛋白转化为可制造生物制品的可行性，并建立了适用于应对新型病毒威胁的快速响应治疗平台。未来的开发可能探索替代的HMW去除策略、连续工艺及扩大临床规模生产。
