鼻腔纳米颗粒疫苗诱导针对刚地弓形虫的交叉株型T细胞免疫

《Pharmaceutics》：Nasal Nanoparticle Vaccine Induces a Cross-Strain T-Cell Immunity Against Toxoplasma gondii

　　

背景/目的：刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）是一种全球分布的人畜共患寄生虫，对人类和动物均造成显著发病负担。VXN-Toxo是一种基于麦芽糊精纳米颗粒（maltodextrin nanoparticles）的鼻内疫苗，含有灭活的弓形虫（T. gondii）寄生虫。在全球动物园开展的一项疫苗接种活动显示，该疫苗在多个物种和地理区域表现出高效力。这些发现表明，VXN-Toxo可能诱导针对在不同地区流行的弓形虫菌株的广泛交叉反应性免疫。方法：为进一步表征免疫机制，研究人员在C57BL/6小鼠中评估了VXN-Toxo诱导的细胞免疫应答。疫苗接种后，用来源于多个弓形虫菌株（代表主要单倍群，包括I型、II型、III型和非典型菌株）的抗原刺激脾细胞。结果：酶联免疫吸附斑点法（ELISPOT）分析表明，VXN-Toxo诱导了强烈的抗原特异性T细胞应答，其特征是在同源和异源抗原刺激下均产生强大的干扰素-γ（IFN-γ）和白细胞介素-17（IL-17）。流式细胞术分析进一步揭示了CD4⁺和CD8⁺ T细胞的活化，并显著存在产生IFN-γ的CD8⁺中央记忆和效应记忆细胞以及CD4⁺效应记忆T细胞。结论：综上所述，这些结果表明VXN-Toxo诱导了广泛的、T细胞介导的免疫应答，具有交叉反应性，并突显其作为人用和兽用疫苗候选制剂的潜力。

**论文解读：VXN-Toxo纳米颗粒疫苗诱导抗弓形虫交叉菌株T细胞免疫**

**一、研究背景与科学问题**

弓形虫病是一种由刚地弓形虫（*Toxoplasma gondii*）引起的人畜共患寄生虫病，该胞内原虫可感染包括人类在内的大多数温血动物。全球约三分之一的人口呈慢性感染状态，感染途径包括摄入未煮熟的肉类、接触被猫粪便中卵囊污染的食物或水源，以及垂直传播。弓形虫在全球广泛分布，在欧洲和北美，寄生虫种群主要由三个克隆谱系（I型、II型和III型）组成，遗传多样性相对较低。其中II型菌株在人类感染中占主导地位，在免疫功能正常个体中通常引起无症状或轻度疾病，但可导致流产、先天性畸形以及免疫缺陷患者的神经系统疾病。I型菌株与更严重的症状性感染相关，包括先天性弓形虫病，并对中枢神经系统产生显著影响。III型菌株通常与轻度或无症状感染相关。相比之下，南美洲的寄生虫种群结构更加多样化，以非典型和重组菌株为主，遗传变异更大，这些非典型菌株与更强的毒力和严重临床表现相关，包括侵袭性眼弓形虫病和危及生命的先天性感染。

在急性感染期间，免疫功能正常的个体会对弓形虫产生有效的免疫应答，其中细胞介导的免疫发挥核心作用，IFN-γ依赖性通路在控制寄生虫复制中起关键作用。然而，这种免疫控制对高毒力的I型菌株和非典型菌株的效果可能较差，因为这些菌株具有独特的毒力决定因子，并能干扰IFN-γ介导的通路从而促进免疫逃逸。急性期后，速殖子分化为缓殖子，在神经元和肌肉细胞中形成细胞内包囊，使寄生虫能够在宿主免疫存在下长期持续存在。

目前弓形虫病的标准治疗基于磺胺嘧啶和乙胺嘧啶。尽管这些药物对活跃复制的寄生虫有效，但存在成本高、治疗周期长和毒性显著等局限，且对组织包囊无效。此外，耐药性的出现进一步影响了其长期疗效。因此，当前治疗策略无法实现寄生虫完全清除，亟需开发新型有效的治疗手段。疫苗接种被认为是最有前景的预防策略。过去十年中，研究者探索了多种疫苗平台（DNA疫苗、活重组疫苗、亚单位疫苗和mRNA疫苗），但几乎都处于临床前阶段。目前尚无获准用于人类弓形虫病预防的疫苗。在兽医学领域，弓形虫病是经济上重要的家畜（尤其是绵羊和山羊）繁殖失败的主要原因，目前仅有基于活减毒菌株的Ovilis? Toxovax疫苗获批用于绵羊，但其稳定性有限且存在毒力返祖风险。

基于麦芽糊精纳米颗粒、装载灭活弓形虫的VXN-Toxo纳米颗粒疫苗（Vaxinano，法国鲁斯）代表了一种有前景且安全的策略。该疫苗通过鼻内途径递送，诱导以IFN-γ产生为主的Th1偏向免疫应答，已在包括非人灵长类在内的多个物种中显示出广泛效力。近期一项覆盖欧洲和美洲20个动物园、涉及58个物种784只野生动物的回顾性研究显示，接种VXN-Toxo后弓形虫病相关死亡率降低了96.7%。然而，由于在多个动物园机构收集和处理大量动物生物样本面临实际困难，无法对暴露于拉丁美洲遗传多样性非典型菌株的动物进行免疫学分析。因此，本研究旨在确定VXN-Toxo是否能诱导针对遗传多样的弓形虫菌株的交叉反应性细胞免疫，以解释其现场条件下的有效性。

**二、主要技术方法**

研究人员使用了以下关键技术方法：（1）纳米颗粒疫苗制备与表征：采用高压均质和超滤法制备阳离子麦芽糊精纳米颗粒（NPL），与灭活的I型RH株弓形虫速殖子总抗原（TE）按1:3重量比混合形成TE/NPL疫苗制剂，通过动态光散射（DLS）和电泳光散射（ELS）表征粒径和表面电荷，利用差示扫描荧光法（NanoDSF）分析蛋白热稳定性，采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（Native-PAGE）验证抗原与纳米颗粒的结合；样本来源于商品化Vero细胞系培养的弓形虫RH株（ATCC, PRA-310）。（2）菌株抗原制备与抗原性比较：从兰斯CRB（法国兰斯）购得不同单倍群菌株（TgH 00001、TgH 00005、TgH 24001A和TgH 42001A），经Vero细胞培养、纯化和冻融灭活制备总抗原（TE），使用酶联免疫吸附试验（ELISA）比较不同菌株间的抗原相似性。（3）动物实验：6周龄雌性C57BL/6小鼠购自Janvier（法国巴黎），对照组4只给予PBS，免疫组8只接受鼻内NPL/TE疫苗（30 μg NPL/剂和10 μg TE/剂），共免疫两次，间隔两周，末次免疫后两周处死取材。（4）免疫应答分析：使用ELISPOT检测脾细胞在多种菌株TE刺激下分泌IFN-γ和IL-17的细胞频率；采用流式细胞术分析CD4⁺和CD8⁺ T细胞亚群中IFN-γ的产生情况，并通过CD44/CD62L标志物分选效应记忆（TeM）和中央记忆（TcM）T细胞亚群。

**三、研究结果**

**3.1 疫苗制剂的表征**

TE的流体力学直径（Z-average = 1227 nm）、多分散系数（PDI = 0.84）和负表面电荷（?21.3 mV）表明其存在异质性粒径分布。NPL的平均直径为96 nm，PDI为0.15，表面电荷为+35 mV。TE与NPL结合后表面电荷由负转正（+30.6 mV），证实了复合物的形成。Native-PAGE显示TE/NPL泳道无游离TE条带，表明抗原结合程度高。NanoDSF分析显示TE/NPL的熔解温度（Tm = 63.1 ± 0.67 °C）高于游离TE（Tm = 61.3 ± 0.28 °C），证实了抗原-纳米颗粒间的相互作用。

**3.2 不同弓形虫菌株灭活后的表征**

ELISA结果显示各菌株TE的OD信号高度一致（TE I为1.705，TE II为1.685，TE III为1.730，TE A2为1.750），同源与异源菌株间的差异小于3%，表明多克隆抗体能以相似方式识别不同菌株的抗原，证实了测试菌株间存在高度抗原保守性。各菌株TE的zeta电位均在?16至?24 mV范围内分布均匀，表明不同TE的表面电荷特征相似。

**3.3 TE/NPL诱导针对不同菌株的全身性细胞免疫应答**

ELISPOT结果显示，疫苗接种小鼠在受到同源抗原（TE I）刺激后，产生IFN-γ的细胞数量显著高于对照组（平均211个斑点对10个斑点），异源抗原（TE II、TE A1和TE A2）也呈现类似趋势，表明诱导了交叉反应性细胞应答。值得注意的是，TE A2刺激诱导了特别强烈的IFN-γ应答（平均1968个斑点），而TE III刺激仅在部分接种动物（5/8）中诱导了IFN-γ产生。IL-17应答也呈现类似模式，接种小鼠在所有测试抗原下的细胞因子分泌水平均高于未接种小鼠。此外，仅在8只接种小鼠中的1只检测到低水平的抗弓形虫特异性IgG，表明VXN-Toxo主要诱导细胞免疫应答。

**3.4 细胞免疫应答由CD4+和CD8+ T细胞驱动**

流式细胞术分析显示，在同源抗原刺激下，接种组CD4⁺ T细胞中产生IFN-γ的频率（中位数 = 0.10%）显著高于未接种组（中位数 = 0.01%），在非典型菌株抗原（A2）刺激下进一步升高（中位数 = 0.19%）。CD8⁺ T细胞区室呈现相似模式，在I型和非典型菌株抗原刺激下，产生IFN-γ的细胞比例分别达到0.10%和0.25%。尽管A2 TE与I型TE之间的差异未达到统计学显著性，但A2 TE刺激后IFN-γ产生细胞比例呈升高趋势，与ELISPOT结果一致。

**3.5 TE/NPL在记忆T细胞亚群中诱导强大的IFN-γ产生**

在同源再刺激（TE I）条件下，接种小鼠大多数T细胞亚群中产生IFN-γ的频率均有增加，这在CD8⁺区室中尤为明显，包括TcM和TeM群体以及CD4⁺ TeM亚群。在异源再刺激（TE A2）条件下呈现类似趋势，IFN-γ应答总体强于TE I刺激，其中CD8⁺ TeM细胞达到最高频率。相比之下，CD4⁺ TcM区室中IFN-γ的产生无论接种状态或再刺激类型均保持在低水平。

**四、讨论与结论**

研究人员证明，VXN-Toxo鼻内疫苗接种在小鼠中诱导了针对同源I型菌株和异源菌株（II型、III型和非典型菌株）的强大细胞免疫应答，这具有重要意义，因为IFN-γ是宿主防御弓形虫的关键保护性免疫成分。流式细胞术显示CD4⁺和CD8⁺ T细胞群体均有助于这种IFN-γ的产生。疫苗接种后观察到的IFN-γ分泌中央记忆CD8⁺ T细胞频率增加表明VXN-Toxo促进了记忆T细胞的生成，但单时间点评估只能提示记忆诱导而非长期抗原特异性应答的直接证据。值得关注的是，非典型菌株A2刺激产生了更强的IFN-γ应答，这可能反映了保守或更具免疫原性的表位能被疫苗诱导的T细胞更有效地识别。IL-17的产生也被检测到，已知其在弓形虫感染早期保护性免疫中发挥作用，特别是促进中性粒细胞向感染部位募集。疫苗制剂的理化表征支持TE/NPL复合物通过阴离子TE抗原与阳离子NPL纳米颗粒间的静电相互作用形成，NPL兼具抗原递送和免疫增强的双重功能。鼻内给药途径靶向鼻相关淋巴组织（NALT），激活Toll样受体信号通路（TLR2和TLR4），促进Th1/Th17免疫应答的发育和全身及黏膜免疫的诱导。VXN-Toxo未诱导显著的体液免疫应答，这与先前结果一致，保护效力主要归因于细胞应答。

鉴于弓形虫菌株间整体遗传保守性超过99%，遗传变异集中在编码RROP18、ROP5和GRA15等分泌毒力因子的少数多态性位点，诱导广泛交叉反应性免疫应答至关重要。与仅针对单一优势抗原的亚单位和表位疫苗不同，VXN-Toxo使用完整灭活RH株，多表位暴露可能促进对不同弓形虫菌株的交叉识别。VXN-Toxo已在同源和异源攻毒模型中验证效力：小鼠模型中，该疫苗对致死性异源攻毒提供了100%的生存保护，与未接种对照组相比脑包囊负担减少70%；接种绵羊在异源攻毒（II型Me49株）后完全免受脑包囊形成。此外，动物园非人灵长类疫苗接种与自然暴露条件下弓形虫病相关死亡率降低96.7%相关。动物园疫苗接种研究还提示VXN-Toxo可能在既往感染个体中发挥有益作用，可延迟疾病进展并降低血清阳性动物死亡率，暗示疫苗可能重新激活预先存在的T细胞应答，为将其探索为慢性或复发性弓形虫感染患者的治疗性疫苗策略提供了可能性。

**结论：** 本研究证明VXN-Toxo诱导了针对代表主要单倍群的广泛弓形虫菌株的强大抗原特异性免疫应答。VXN-Toxo引发的免疫应答主要由细胞免疫驱动，其特征是CD4⁺和CD8⁺ T细胞亚群产生IFN-γ。这些发现表明，VXN-Toxo诱导了针对遗传多样性寄生虫菌株的广泛交叉反应性细胞免疫应答，与先前在其他接种动物物种中报告的现场有效性背后的可能免疫学机制一致。